[发明专利]一种纳米抗体与人胎盘碱性磷酸酶的融合蛋白及应用

说明书

本发明公开了一种纳米抗体与人胎盘碱性磷酸酶的融合蛋白，所述融合蛋白由纳米抗体或其可变区片段与人胎盘碱性磷酸酶报告基因蛋白串联而成，本发明还提供了所述融合蛋白在制备CEACAM5抗原免疫检测试剂盒中的应用。该融合蛋白用于免疫标记技术的免疫检测，保持了良好的酶和抗体的生物学活性，具有较高的检测效率。

技术领域

本发明公开了一种融合蛋白及其免疫学应用，属于多肽技术领域，更具体地，属于免疫球蛋白技术领域。

背景技术

碱性磷酸酶(alkaline phosphatase或ALP)是广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织经肝脏向胆外排出的一种酶，属于同源二聚体蛋白，分子量为56KDa。ALP每个单体由449个氨基酸组成，完整的ALP分子呈现典型的α/β的拓扑结构，同时每个单体均具有一个活性中心，活性中心区域由Asp101-Ser102-Ala103三连体、Arg166、水分子、三个金属离子及其配体氨基酸组成。ALP被phoA基因编码，与很多分泌蛋白一样，在细胞质内合成氨基末端带有信号肽的单体前体，信号肽引导前体跨内膜运输后被切除，同源二聚体形成。这种酶能催化核酸分子脱掉5'磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5'-P末端转换成5'-OH末端。但它不是单一的酶，而是一组同功酶。目前已发现有ALP1、ALP2、ALP3、ALP4、ALP5与ALP6六种同功酶，其中第1、2、6种均来自肝脏，第3种来自骨细胞，第4种产生于胎盘及癌细胞，而第5种则来自小肠绒毛上皮与成纤维细胞。除来源于胎盘外所有哺乳动物的ALP同工酶都能被高精氨酸所抑制；除来源于肠和胎盘外所有的ALP同工酶都能被左旋咪唑所抑制；而除了来源于胎盘的ALP(PALP和SEAP)外，几乎所有的ALP都能在65℃2小时即被灭活。

碱性磷酸酶的测定方法有很多种，我国曾应用较广的为磷酸苯二钠比色法，但现在应用较多的是连续检测法。原理为以磷酸对硝基酚为底物，2-氨基-2-甲基-1-丙醇或二乙醇胺为磷酸酰基的受体。在碱性环境下，ALP催化4-NPP水解产生游离的对硝基酚，在碱性溶液中转变成黄色。根据405nm处吸光度增高速率来计算ALP活性单位。ALP也是目前免疫诊断试剂产品最常用的标记酶之一。与辣根过氧化物酶(HRP)相比，ALP用作标记酶的优点是，稳定性高、灵敏度高，缺点是成本高，标记困难。

在研究中最常用的ALP包括细菌碱性磷酸酶(Bacterial alkaline phosphatase，来源于Escherichia coli C₄)、SAP(Shrimp alkaline phosphatase，来源于一种北极虾)、小牛肠碱性磷酸酶(Calf Intestinal Alkaline Phosphatase，CIAP)和胎盘碱性磷酸酶(Placental Alkaline Phosphatase，PLAP)四种。其中，由于SAP是四种碱性磷酸酶中最容易被灭活的，因此被常应用于分子生物学领域中，主要用作核酸的去磷酸化。因为DNA通常会在5'端结合磷酸基团，用SAP去磷酸化能防止DNA分子5'端与3'端连接，从而在后续步骤准备好之前让DNA分子抑制处于线性化状态。同样的原理，该酶还可通过去磷酸化用作放射标记示踪。除此之外，碱性磷酸酶还可被作为标记酶广泛应用于酶联免疫测定。以竞争法检测小分子抗原为例，抗体先与固相载体结合，然后让待测样品与事先经ALP标记过的该抗原竞争地与抗体结合，洗去未反应的过量ALP-抗原，加入显色底物，则可以通过与按梯度浓度变化的标准品绘出的标准曲线对比从而知道待测样品中抗原的浓度。目前，绝大部分使用的为小牛肠碱性磷酸酶，主要原因在于其比活性高。市售的CIAP的比活性根据制造商、品级的不同而多种多样。此外，基本骨架中包含1,2-二氧杂环丁烷或吖啶酮的CIAP可以使用各种高灵敏度发光基质，以提高免疫测定的灵敏度。

在传统的免疫标记技术中，辣根过氧化物酶标记在蛋白的赖氨酸残基位置。相对于常规的四链抗体的scFv而言，纳米抗体在亲和力方面与其对应的scFv相当，但在可溶性、稳定性、对聚集的抗性、可重折叠性、表达产率以及DNA操作、文库构建和3-D结构测定的容易性方面超越scFv。将纳米抗体用于传统的免疫学检测会极大提高检测效率，因此纳米抗体的检测应用具有极大地市场前景。