[发明专利]一种SSR指纹图谱鉴别秋海棠品种的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种构建秋海棠SSR指纹图谱来鉴别秋海棠品种的方法，首先抽提秋海棠品种的DNA，PCR扩增和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测初步筛选SSR标记，然后使用6对核心序列SSR荧光标记引物进行PCR扩增，产物经荧光毛细管电泳检测构建秋海棠品种的SSR指纹通图谱。本发明可以在实验室根据SSR位点的多态性，利用PCR扩增、凝胶电泳和毛细管电泳技术鉴定秋海棠品种，在时间上充分提高了试验效率，具有操作方便、快速、检测准确、低成本等优势，并且鉴定结果不受环境、取样时间等影响，从DNA水平为评价秋海棠种质资源和解决其品种产权纠纷提供科学、有效的参考依据。

技术领域

本发明属于植物品种分子鉴定技术领域，涉及一种秋海棠SSR指纹图谱的构建方法及其应用。

背景技术

秋海棠(Begonia grandis)为秋海棠科秋海棠属的观赏植物，可观叶、观花，在我国已有多年盆花栽培史。近年来，随着秋海棠的需求量日益增加，种植面积逐年扩大。但是由于秋海棠品种众多和区域间引种利用，地方品种遗传相似性高，传统的形态学和细胞学的鉴定结果易受环境因素的影响，导致判定结果不一致的问题，同时田间测定周期长，不能及时、快捷地为新品种侵权、盗窃等案件提供鉴定依据。

DNA指纹图谱能够从DNA水平上鉴定品种间的差异或遗传相似性。而微卫星(又称简单重复序列，SSR)是由1-6个核苷酸组成的短序列串联重复多次而组成的一段DNA。由于微卫星中重复单元的重复次数不同，因而扩增出的微卫星序列的长度呈现多态性。微卫星序列具有多态性较高，重复性和稳定性好等特点，是十分有效的分子标记，被广泛应用于品种鉴定、指纹图谱构建等领域。

随着国际上对植物新品种保护制度不断的完善，越来越多的育种者对新品种权保护的意识增强，积极申请新品种保护。为了有效地保护我国秋海棠的品种知识产权和育种者的权利，急需开发有效的技术措施对秋海棠品种进行精确鉴定，从DNA水平上给予秋海棠品种独特的指纹身份。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的高效、准确、低成本的利用SSR指纹图谱鉴别秋海棠品种的方法，并提供该方法的应用。本发明利用SSR指纹图谱技术对秋海棠品种进行鉴定，从而达到保护秋海棠品种的目的。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

一种SSR指纹图谱鉴别秋海棠品种的方法，首先抽提秋海棠品种的DNA，PCR扩增和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测初步筛选SSR标记，然后使用6对核心序列SSR荧光标记引物进行PCR扩增，产物经荧光毛细管电泳检测构建秋海棠品种的SSR指纹通图谱。

根据所述的一种SSR指纹图谱鉴别秋海棠品种的方法，该方法包括下述步骤：

(1)提取待鉴别样品的DNA：

采用天根试剂盒从秋海棠叶片中提取待鉴定样品秋海棠基因组DNA，从0.1g秋海棠幼嫩叶片中提取基因组DNA，最后将DNA稀释至50ng/ul，置于-20度冰箱中保存备用；

(2)SSR标记的初步筛选：

选取50个秋海棠SSR标记引物序列，利用待鉴定秋海棠品种对这些引物进行筛选，PCR反应总体积12.5ul，包括6.75ul的2x EasyTaq PAGE Buffer、4.75μL ddH₂O、10pmol正向和反向引物各0.5μL，0.5μl的DNA；