[发明专利]一种大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种大肠杆菌基因工程菌，其导入了携带fimH基因的重组质粒。本发明还公开了基因工程菌的构建方法。本发明进一步地公开了基因工程菌在发酵生产L‑苏氨酸中的应用。本发明通过构建过表达fimH基因的大肠杆菌基因工程菌，使大肠杆菌在发酵产L‑苏氨酸过程中生物膜产量提高，并且黏附性增加，菌群数量增加，提高了L‑苏氨酸的产量和糖转化率，缩短了发酵周期。

技术领域

本发明涉及L-苏氨酸发酵，具体涉及一种大肠杆菌基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

L-苏氨酸是由W.C.Rose 1935年从纤维蛋白水解产物中分离和鉴定出来的一种氨基酸，现已证明是最后被发现的必需氨基酸，人体自身不能合成，必须从食物中摄取。L-苏氨酸作为食品添加剂广泛应用于饲料工业、保健食品和医药工业，由于L-苏氨酸的作用广泛，近些年全球苏氨酸的市场需求高速增长，未来苏氨酸的市场仍将快速增加，苏氨酸的需求量也将不断增大。

L-苏氨酸的制备方法主要有蛋白质水解法、化学合成法、微生物发酵法，微生物发酵法具有节约资源，成本低，环境污染小等优点，已经广泛应用于L-苏氨酸生产中。随着现代社会基因工程技术的如飞猛进，工业微生物和工业技术应用需求量增多，特别是工业微生物载体系统的构建，为优良的L-苏氨酸生产菌株的筛选和产酸水平的提高提供可靠的技术保障，使微生物直接发酵法生产L-苏氨酸成为一种廉价的工业化生产方法。现阶段能够生产苏氨酸的微生物有埃希氏菌属、棒状杆菌属、沙雷氏菌属等。大肠杆菌产苏氨酸现在普遍运用到微生物发酵实验中，其优点是菌种繁殖快，发酵周期短，成本低等特点，但相对于氨基酸行业的需求，虽然产量稳定增加，但是速度还是比较慢。

发明内容

发明目的：为了解决现有大肠杆菌发酵生产L-苏氨酸时产量低、发酵周期长的问题，本发明提供了一种大肠杆菌基因工程菌，本发明进一步提供了所述大肠杆菌基因工程菌的构建方法，本发明更进一步地提供了所述大肠杆菌基因工程菌在发酵生产L-苏氨酸中的应用。

技术方案：本发明所述一种大肠杆菌基因工程菌，其导入了携带fimH基因的重组质粒。本发明从医学领域出发，大多数的细菌感染与生物膜的形成息息相关，医学中采用减少生物膜的形成降低细菌的感染；本发明首次提出通过增加大肠杆菌的生物膜量从而增加大肠杆菌的粘附性，可以粘附在非生物表面，改善了发酵生产L-苏氨酸的过程中L-苏氨酸的产量和发酵周期。

其中，所述原始大肠杆菌为CCTCC NO:M 2015233；所述重组质粒为携带fimH基因的PET-28a质粒。

本发明进一步地提供所述大肠杆菌基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：

(1)提取原始大肠杆菌的基因组；

(2)以步骤(1)提取得到的基因组为模板，采用PCR技术扩增fimH基因；

(3)将步骤(2)得到的fimH基因插入PET-28a质粒的NcoⅠ/XbaⅠ酶切位点间，得到携带fimH基因的重组质粒；

(4)将步骤(3)得到的重组质粒转化到E.coli DH5α的感受态细胞中，从E.coliDH5α中提取重组质粒；

(5)将步骤(4)提取得到的重组质粒转化到原始大肠杆菌的感受态细胞中，即得大肠杆菌基因工程菌。

其中，步骤(1)中所述原始大肠杆菌赠自中国科学院上海生命科学研究院，所述大肠杆菌已申请专利201510199036.1并进行了保藏，保藏编号为CCTCC NO:M 2015233，菌株号为CIBTS1688。

其中，步骤(2)中所述PCR使用的引物如下：

fimH-F：GGATAACAATTCCCCTCTAGAATGAAACGAGTTATTACCCTGTTTGC