[发明专利]一种微生物肥料动态菌剂配方的制定方法和精准应用

权利要求书

1.一种微生物肥料动态菌剂配方的制定方法，包括以下步骤：

(1)土壤样本处理：抽提并纯化样本中的微生物DNA，采用515F/806R PCR引物对微生物DNA的16S rRNA基因的V4高变区进行扩增；

(2)测定土壤中微生物总量：提取土壤中微生物的总DNA，然后以16S rRNA作为目标序列，使用515F/806R PCR引物进行绝对定量，以大肠杆菌作为标准品；

(3)鉴定土壤中不同微生物菌群比例：通过高通量基因测序技术对扩增的产物进行测序，对测序结果进行分析评估，将测序结果与16S rRNA的微生物基因序列数据库进行对比，确定土壤样本中不同活性微生物菌群的相对含量和比例；

(4)确定菌剂配方：将测定的微生物菌群含量与该地区土壤微生物数据库中该微生物菌群的含量分布进行比较，若相对含量≤25％，则提供的菌剂配方中该微生物菌群的活性含量不低于5×10⁹cfu/g(mL)；若相对含量＞25％，则提供的菌剂配方中该微生物菌群的活性含量不低于1×10⁹cfu/g(mL)；

(5)微生物肥料发酵：将步骤(4)中确定的菌剂配方与发酵基质进行混合发酵，当发酵基质的pH值到达或接近5.0时，则发酵成熟。

2.根据权利要求1所述的一种微生物肥料动态菌剂配方的制定方法，其特征在于：所述的步骤(1)中采用微珠打碎和/或超声的方法来提取样本中的微生物DNA。

3.根据权利要求1或2所述的一种微生物肥料动态菌剂配方的制定方法，其特征在于：所述的步骤(1)中采用的515F/806RPCR引物为515F-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA，806R-GGACTACHVGGGTWTCTAAT。

4.根据权利要求1所述的一种微生物肥料动态菌剂配方的制定方法，其特征在于：土壤中的微生物菌群包括光合菌、硝化细菌、乳酸菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、双歧杆菌、酵母菌、芽孢杆菌、木霉菌、黑曲霉菌、放线菌、解钾菌、解磷菌、固氮菌。

5.根据权利要求1所述的一种微生物肥料动态菌剂配方的制定方法，其特征在于：16SrRNA的微生物基因序列数据库的构建方法为通过公共数据库选择土壤样本中常见几百种菌株的名称和其约1.8kb大小的16SrRNA基因的DNA序列，数据库中包括菌株的详细系统分类名称和DNA序列信息，公共数据库包括RDP、SILVA、GreenGene、UNITE。

6.根据权利要求4所述的一种微生物肥料动态菌剂配方的制定方法，其特征在于：土壤微生物数据库的建立方法为：通过高通量测序获得某一地区的大量土壤样本中微生物组成分布比例信息。

7.根据权利要求1或4所述的一种微生物肥料动态菌剂配方的制定方法，其特征在于：所述的发酵基质包括无毒植物块、茎、果实，包括蔬菜、水果、根茎、菌类植物、子实体及本草类。

8.根据权利要求7所述的一种微生物肥料动态菌剂配方的制定方法，其特征在于：发酵基质中包括70％的水和5～8％的蔗糖，质量分数。

9.根据权利要求8所述的一种微生物肥料动态菌剂配方的制定方法，其特征在于：所述的蔗糖是一种没有经过高度精炼的、带蜜成型的、颜色比较深的甘蔗成品糖，主要是指黑糖和红糖。

10.根据权利要求7或8所述的一种微生物肥料动态菌剂配方的制定方法，其特征在于：步骤(5)中发酵过程为：在25～30℃的温度下发酵7d后，没有大量气体产生时，密封发酵罐至少保持15-20d；当温度稳定后，且pH到达或接近5.0时显示发酵成熟，并冷却；发酵结束，过滤分离后分别得到固态和液态微生物肥料。