[发明专利]一种提高比活力的碱性蛋白酶BmP突变体及其编码基因

权利要求书

1.一种提高比活力的碱性蛋白酶BmP突变体，其特征在于，所述突变体为氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示的蛋白酶BmP的突变体，其中突变位点为第236位和293位，所述的突变体包括4个组合突变体，分别命名为P2、P3、P8和P9，其中P2包含的突变位点为N236G和N293K；P3包含的突变位点为N236G和N293M；P8包含的突变位点为N236D和N293K；P9包含的突变位点为N236D和N293M。

2.根据权利要求1所述的提高比活力的碱性蛋白酶BmP突变体，其特征在于，所述的碱性蛋白酶BmP突变体P2、P3、P8和P9的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQID NO.19和SEQ ID NO.20所示。

3.一种编码权利要求1所述提高比活的碱性蛋白酶BmP突变体的基因，其特征在于，所述碱性蛋白酶BmP突变体P2、P3、P8和P9的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

4.一种获得权利要求1-2任一所述提高比活力的碱性蛋白酶BmP突变体的方法，其包括如下步骤：

1)碱性蛋白酶BmP基因合成及克隆：根据莫海威芽孢杆菌碱性蛋白酶基因序列直接合成目的基因，然后以目的基因为模板进行PCR扩增，将扩增得到的片段克隆到载体phyP43L，得到表达载体phyP43L-BmP；2)定点饱和突变：以构建好的phyP43L-BmP载体为模板进行PCR扩增；将扩增好的PCR产物进行琼脂糖电泳并纯化回收PCR产物；用限制性内切酶DpnI将原始质粒分解，将分解完的产物用热激法转入大肠杆菌Top10，通过菌液PCR验证重组转化子，提取验证正确转化子的质粒进行测序，从而确定相应的突变体；将测序正确的突变体，通过电转化转入枯草芽孢杆菌WB600。

5.根据权利要求4所述的突变方法，其特征在于，所述步骤1)中PCR扩增引物为：

R：5'-ATCGGGATCCGCTCAACCGGCGAAAAATGTT-3'；

F：5'-TCTAGCGGCCGC TTATTGAGCGGCAGCTTCGAC-3'。

6.一种包含权利要求3所述基因的重组载体。

7.一种包含权利要求3所述基因的宿主细胞。

8.一种权利要求1所述提高比活的碱性蛋白酶BmP突变体在饲料加工、酿造、洗涤或食品加工领域的应用。