[发明专利]乌龟血清对人肺癌细胞抑制作用的应用

说明书

本发明公开了乌龟血清对人肺癌细胞抑制作用的应用，属于生物化学技术领域；包括以下步骤：(1)提取乌龟血清；(2)CCK‑8法测定乌龟血清对肺癌肿瘤细胞增殖的影响；(3)DAPI染色检测细胞核形态变化；(4)Western bloting检测AKT/mTOR/S6磷酸化情况；(5)Annexin V‑FITC/PI检测细胞凋亡率。本发明的有益效果：本发明的数据建立在乌龟血清对多种肿瘤细胞具有非常明显的体外增殖抑制活性，其中对人肺癌肿瘤细胞增殖抑制较强的基础之上。

技术领域

本发明属于生物化学与分子生物学技术领域，具体涉及乌龟血清对人肺癌细胞抑制作用的应用。

背景技术

动物血清有报道可作为肿瘤细胞的抑制剂，可以作为肿瘤治疗的一种药物，可以抑制肿瘤细胞的生长而对正常细胞无影响。近些年来，血清以其独特的保健作用越来越引起人类的关注，其产业也迅速崛起，成为极有发展潜力的新兴领域。有研究发现豚鼠血清对人淋巴瘤细胞有抑制，而对正常的细胞无影响；也有观察到不同种属来源和浓度的动物血清对体外培养的肿瘤细胞(A549、MCF-7、BGC-823)生长的影响，结果表明虽然不同种属来源的动物血清对肿瘤细胞生长的影响作用各不相同，但随着加入量的增加，大多数血清会对肿瘤细胞的生长产生负效应等等。

乌龟(Chinemys reevesii)是人类普遍饲养的动物，其肉味鲜美营养丰富，应用价值广泛，龟甲、龟血、龟肉等具有抗肿消炎增强免疫力等多方面的作用，是我国首批列为药食同源的保健疗效食品之一。近年来，乌龟(Chinemys reevesii)由于其较高的营养价值、药用价值、研究价值和观赏性已经得到了人们的广泛认可，作为这么一类药用价值极高的动物，目前却尚未见到关于其血清对肿瘤细胞抑制作用的研究报道。

发明内容

鉴于以上所述，本发明的目的在于提供乌龟血清在人肺癌细胞中增殖抑制的应用。

本发明采用的技术方案为：乌龟血清对人肺癌细胞抑制作用的应用，步骤如下：

(1)提取乌龟血清：无菌条件下于乌龟心脏采血，室温静置2h彻底凝固后，3000r/min，离心20min，分离血清，56℃水浴灭活30min，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，置-20℃条件下低温保存，备用，使用前用DMEM培养液分别配置成含有1％、5％和10％乌龟血清的DMEM细胞培养液；

(2)CCK-8法测定乌龟血清对人肺癌肿瘤细胞增殖的影响：将对数生长期的肺癌肿瘤细胞浓度调整为1×10⁴个/mL，加入96孔板中，100μL/孔，在37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，弃上清，分别加入步骤(1)中配置的浓度为1％、5％、10％乌龟血清的DMEM细胞培养液，每个浓度设6个复孔，以含有10％小牛血清的DMEM细胞培养液为对照实验，继续培养24h，CCK-8法测定450nm纳米处吸光度OD值，重复实验三次，记录下平均数据；

(3)DAPI染色检测细胞核形态变化：把处于对数生长期的肺癌肿瘤细胞接种于6孔板，密度约2×10⁸/L，在37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，将细胞分为空白对照组和实验组，实验组中分别加入步骤(1)中配置的浓度为1％、5％、10％乌龟血清的DMEM细胞培养液，以含有10％小牛血清的DMEM细胞培养液为对照组，在37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养24h后用PBS洗清多次，避光条件下用质量浓度为1mg/L的DAPI染色3min，染色结束后再用PBS避光条件下清洗多次，将染色清洗处理好的细胞放置在荧光显微镜下观测和拍照分析；