[发明专利]一种用于培养扩增牙髓干细胞的血清/血浆替代物

说明书

本发明公开了一种用于人牙髓干细胞培养扩增的血清/血浆/血小板替代物，所述替代物包括：（1）5‑羟色胺类物质；（2）玻连蛋白；（3）前列腺素类物质；（4）柠檬酸或柠檬酸盐。使用该替代物培养牙髓干细胞，避免了因培养体系批次间差异，造成所培养的间充质干细胞性质不同的可能性。此外，使用该体系培养牙髓干细胞，在细胞治疗过程中将避免因动物血清或血浆引起的人畜共患病，以及因细胞治疗引起的人体免疫反应的风险。本发明的血清/血浆/血小板替代物，不仅适用于人牙髓干细胞培养扩增，也适于其它组织来源间充质干细胞的培养，应用前景广阔。

技术领域

本发明属于细胞生物学领域细胞增殖范畴，具体一种用于人牙髓干细胞培养扩增的血清/血浆/血小板替代物，培养包括牙髓干细胞在内的人间充质干细胞培养时，使用的一种胎牛血清/血浆、或人血清/血浆以及富血小板的人血浆替代物，从而达到快速培养扩增人间充质干细胞尤其是牙髓干细胞的目的。

背景技术

间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSC）是一种成体干细胞，具有成骨、成脂肪和呈软骨能力。除多向分化能力外，体外培养的MSC尚具有以下功能：（1）基于促血管新生机制的组织修复能力；（2）基于旁分泌机制的免疫调节作用；（3）基于旁分泌及细胞间接触机制的造血支持作用。因此，MSC不但适用于骨和软骨的修复，可用于植物抗宿主病、系统性红斑狼疮等免疫相关疾病的治疗，以及处理因糖尿病及冠心病引起的微小血管阻塞。鉴于此，在美国NIH注册的有关MSC的临床试验已经近800项。在加拿大、新西兰、韩国、日本等国家，政府已经批准MSC作为一个药物，用于移植物抗宿主病、溃疡性结肠炎、骨关节炎、心肌梗塞等疾病的治疗。国内也有研究者将MSC或牙髓干细胞以药物的形式，申报国家食品与药物监督管理局，开展相关的临床试验，有些申请已经获得批准。因此，作为一种细胞药物，MSC包括牙髓干细胞具有广阔的应用前景。

研究发现，多种组织或器官中存在MSC，如骨髓、脂肪、脐带、胎盘、牙髓、肌肉、肝脏、心脏等。目前，常用的组织来源包括骨髓、脂肪、脐带、胎盘及牙髓。这些不同组织来源的MSC，常有不同的名称，如脂肪干细胞、胎盘干细胞及牙髓干细胞等，其实，都应属于间充质干细胞的范畴。与脂肪、骨髓、脐带和胎盘等组织不同，一枚牙齿中牙髓含量极少，所含MSC数量极低。另外，我国FDA发布的细胞产品质量指导原则中，建议尽量不使用异种血清（常指胎牛血清）扩增细胞。因此，将牙髓干细胞应用于临床，尤其是以药物形式用于临床，首先要解决的是培养扩增的问题。培养扩增牙髓干细胞必然面对两个难题：（1）培养扩增时宜选用无血清培养基；（2）使用这种培养基在大量扩增牙髓干细胞的同时，要维系细胞的“干性”（stemness）。

为避免异种血清引起的人畜共患病及免疫反应等问题，有人提出使用浓缩人血小板替代牛血清，用于牙髓干细胞的培养，并获得了满意的效果，获得的干细胞数量是使用相同浓度胎牛血清培养所获得细胞数量的2倍（Govindasamy V, et al. Human plateletlysate permits scale-up of dental pulp stromal cells for clinicalapplications. Cytotherapy, 2011; 13:1221-33）。然而，浓缩血小板是一种血液制品，在没有灭活病毒的情况下，仍然有传播传染病的风险；而常规的灭活程序，如白蛋白制备程序，60℃孵育12小时，常使多种细胞因子失活，使浓缩血小板丧失了支持细胞增殖的能力。另外，血小板个体来源不同，其作用能否保证稳定，亦即，能否保障所获得MSC的批次间稳定性等，也是必须考虑的问题。因此，利用一种化学成分清楚、无血清成分的培养基培养扩增牙髓MSC，对治疗的安全性和有效性，都是十分必要的。

发明内容

本发明之目的在于提供一种胎牛血清/血浆、或人血清/血浆以及富血小板的人血浆替代物，从而配制一种或几种无血清、化学成分清晰的培养基，适用于培养间充质干细胞，尤其是牙髓来源的间充质干细胞。

为解决上述技术问题，本发明采取的方案如下。