[发明专利]基于微流控芯片检测三种呼吸道病原体的试剂盒及其使用方法

说明书

本发明公开了一种基于微流控芯片的检测呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的试剂盒以及使用方法，该试剂盒包括有主动控制流路的多通量微流控核酸检测芯片、预装干粉检测试剂和阳性质控品；所述预装干粉检测试剂含有呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的特异性保守序列的引物及TaqMan荧光探针。本发明的试剂盒采用的是微流控芯片技术，加样后所有操作都由仪器完成，操作简便，速度快，可在30～60min内完成检测，且不会造成污染；采用TaqMan探针荧光PCR技术，针对呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌进行检测，设计引物和探针的序列在呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的基因中都非常保守，特异性强，并能够在2小时内获得检测结果，灵敏度可达10copies/μL。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种基于微流控芯片的检测呼吸道腺病毒、肺炎链球菌和百日咳杆菌的试剂盒及其使用方法。

背景技术

呼吸道腺病毒(Respiratory Adenovirus,ADV)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae,SP)和百日咳杆菌(Bordetella pertussis,BP)是造成儿童呼吸道疾病的常见病原体，对婴幼儿健康造成很大的威胁，ADV、SP和BP感染已成为全球性的问题。分子诊断技术可以满足对ADV、SP和BP快速诊断的需求，并且由于它们的遗传物质都为脱氧核糖核酸，样本提取后不需要进行逆转录过程，可以直接进行分子检测，所以能够快速、准确地进行病原体筛选，从而配合以正确的治疗，减少抗菌药物的滥用。

呼吸道腺病毒是一种无外壳的双链DNA病毒，已知的有68种，分为A、B、C、D、E、F和G七个亚群，会引起呼吸道感染的主要为B组的3型、4型和7型。可以引起多种临床疾病，如感冒、支气管炎和肺炎，还可以导致急性发热性咽喉炎、咽结膜炎等疾病，5岁及以下儿童为易感人群。呼吸道腺病毒感染起病缓慢，首先表现为发热、咳嗽等，高热(39～41℃)持续8～14天，起病后3～4天出现呼吸困难，肺部体征出现较晚，可见肺外病症如肾病、肝肿大等。呼吸道腺病毒感染可能会很严重，尤其对免疫力低下的病人，会出现呼吸衰竭、传播性感染、出血性膀胱炎、神经性疾病，甚至死亡。呼吸道腺病毒常经空气飞沫传播，密切接触(手-鼻)传播等。多发生在冬末、春初，在婴幼儿、家庭、医院及新兵等群体中常可引起流行。

肺炎链球菌是革兰氏阳性菌，菌体似矛头状，成双或成短链状排列，5％～10％正常人上呼吸道中携带此菌，一般不致病；有毒株其致病性，与荚膜有密切关系，尤其在呼吸道病毒感染后或婴幼儿、年老体弱者易发生肺部感染。肺炎链球菌可引起大叶性肺炎、脑膜炎、支气管炎等疾病，也是鼻窦炎、急性细菌性中耳炎和超过幼儿期的结膜炎的最常见原因。典型的大叶性肺炎起病急骤，病人有高烧、寒颤，开始时有阵发性干咳，不久有少量粘液痰，随后痰变黄色，呈粘脓性。据WHO估计，肺炎链球菌性疾病已经成为5岁以下儿童中疫苗可预防性疾病的首位致死因素，每年死于肺炎链球菌感染的人中5岁以下儿童占一半，甚至更多，发展中国家发生率与死亡率更高。

百日咳杆菌为革兰氏阴性菌，是小儿常见的急性呼吸道传染病，也能够感染青少年和成人。百日咳的特征为阵发性痉挛性咳嗽，咳嗽末伴有特殊的吸气吼声，病程较长，可达数周甚至3个月左右，故有百日咳之称。病人，尤其是症状轻微的非典型病人是重要的传染源，主要经飞沫传播。易感儿童接触病人后发病率接近90％，一岁以下患儿病死率高。百日咳潜伏期1～2周，发病早期(卡他期)仅有轻度咳嗽。细菌此时在气管和支气管粘膜上大量繁殖并随飞沫排出，传染性最大。1～2周后出现阵发性痉挛性咳嗽(痉挛期)，这时细菌释放毒素，导致粘膜上皮细胞纤毛运动失调，大量粘稠分泌物不能排出，刺激粘膜中的感受器产生强烈痉咳，呈现出特殊的高音调鸡鸣样吼声。形成的粘液栓子还能堵塞小支气管导致肺不张和呼吸困难、紫绀，此外可伴有呕吐、惊厥。4～6周后逐渐转入恢复期，阵咳减轻，趋向痊愈，但有1～10％病人易继发溶血性链球菌、流感杆菌等的感染。