[发明专利]一种快速鉴定生殖冷冻用玻璃化液的方法及其装置

说明书

本发明涉及一种快速鉴定生殖冷冻用玻璃化液的方法及其装置。本发明所述方法包括以下步骤：取待测溶液置于‑70～‑90℃中冷冻处理5～10s，观察经冷冻处理后所述溶液呈现的外观和流动状态，判断所述溶液是否为生殖冷冻用玻璃化液；如果所述溶液经冷冻后表现为透明的流动状态，则所述溶液属于生殖冷冻用玻璃化液；如果所述溶液经冷冻后呈现为白色且不流动，则所述溶液不属于生殖冷冻用玻璃化液。与常规检测方法相比，本发明所述方法具有操作简单、耗时短以及在生殖冷冻前即能实施检测的优点，可避免由于试剂的原因导致生殖冷冻失败，减少不必要的损失。

技术领域

本发明涉及生殖冷冻领域，具体而言，涉及一种快速鉴定生殖冷冻用玻璃化液的方法及其装置。

背景技术

生殖冷冻保存是指通过特殊的保护措施和降温程序，使生殖细胞和胚胎等在-196℃条件下停止代谢，而升温后又回复代谢能力的技术。随着体外受精-胚胎移植及其衍生技术的不断发展，涉及生殖细胞和胚胎的生殖冷冻保存技术已经成为人类辅助生殖领域或动物育种领域中必不可少的组成部分。

目前，常规的生殖冷冻技术包括慢速冷冻法和玻璃化冷冻法。

其中，慢速冷冻法是大多数哺乳动物生殖冷冻保存的主要方法。该方法选择较低浓度的渗透性防冻剂，采用缓慢降温和快速解冻的方法来保存冷冻生殖。常规慢速冷冻法可以分为以下6个步骤：(1)室温下生殖细胞或胚胎置于低分子量渗透性防冻液中5～10min，使生殖细胞/胚胎和冷冻液间达到平和；(2)在-5～-7℃植冰；(3)以0.2～2℃/min的速度缓慢降温；(4)降温到-30～-70℃，投入液氮中保存；(5)以250℃/min的速度快速解冻(例如25℃水中)；(6)在培养或移植前，室温下除去防冻剂^[1]。

玻璃化冷冻是通过高浓度冷冻保护剂在冷冻过程中固化形成无结构的玻璃样物质从而减少细胞内外冰晶的形成以保护生殖的冷冻方法。所述无结构的玻璃样物质的质点不规则排列，能始终保持溶液的水分子和离子分布，使跨膜物质的浓度和渗透压差别不大，从而避免细胞内产生冰晶对细胞的机械性损伤，也消除细胞外冰晶形成引起的理化损伤^[2]。与慢速低温冷冻法相比，玻璃化冷冻法无需降温仪精密控制降温速度，仅需1分钟即可完成，简化操作过程，大大缩短操作时间，同时对细胞的冷冻损伤更小。因此，玻璃化冷冻技术已经成为生殖冷冻技术新方向。

在玻璃化冷冻过程中，生殖细胞和胚胎等需要严格按照顺序依次经历至少2种液体，即冷冻用平衡液和冷冻用玻璃化液，经充分浸泡、渗透、平衡，然后装载至冷冻载杆上，并且直接投入液氮中，可实现快速降温达到玻璃化状态，从而避免冰晶结晶对细胞产生损伤。如果经历液体的顺序不对，就不能获得玻璃化的状态，那么在解冻复苏时，生殖细胞和胚胎就会死亡。因此，严格的液体渗透顺序和配方正确的试剂是保证玻璃化冷冻效果的基本条件。

但是，在实际应用过程中，由于液体试剂种类繁多，配制复杂，会出现配置错误的问题。另外，在常温下，平衡液和玻璃化液都呈现为粘稠的透明液体状，二者呈现的外观过于相似，容易混淆。无论是将玻璃化液配制错误，例如，遗漏加入某种成分，还是将玻璃化液与其他溶液，例如平衡液混淆，都会导致严重的后果。稍有不慎，就会导致该批次的生殖细胞或胚胎全部损伤死亡，对患者、医院造成巨大的经济损失，是严重的医疗事件，影响医患关系。

因此，如何及时发现问题，采取必要措施，防患于未然，具有十分重要的意义。

目前，发现这一问题的现有方法主要是通过冷冻保存后解冻复苏时观察生殖细胞或胚胎存活情况并结合经验来鉴定。现有的鉴定方法存在以下缺点：

1、发现过程的耗时周期长，往往是经历了冷冻、保存后，在患者需要解冻生殖细胞或胚胎移植时才出现不良的后果，至少1个月以后才有可能引起操作者的注意。

2、发现问题时，往往受累生殖细胞或胚胎的数量已经很大，会出现胚胎大量死亡，大范围影响患者利益。