[发明专利]一种小鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养

权利要求书

1.一种小鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养方法，其特征在于，包括以下步骤：腹腔注射肝素、再注射戊巴比妥钠麻醉处死ICR小鼠；（2）将小鼠后腹面向上固定于板上，无菌条件下取股骨和胫骨，置于75%酒精浸泡消毒；（3）无菌操作台内，PBS清洗3次，剪掉股骨和胫骨的骨骺端，露出骨髓腔；（4）用10ml针管，吸取含双抗的培养基冲出骨髓，反复吹打；（5）收集冲下来的液体，用percoll分离液，密度梯度法离心，取中间界面处白色层；（6）白色层用含双抗的PBS液离心清洗两次；（7）取细胞滤液用锥虫蓝染色检测细胞活性；（8）细胞计数后用完全培养基重悬接种到包被后的培养瓶，置于37℃、5% CO₂环境中培养；（9）细胞形态鉴定；（10）ELISA法检测；（11）RT-PCR检测。

2.根据权利要求1所述的小鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤（1）所用戊巴比妥钠浓度为30mg/kg，肝素100U/kg。

3.根据权利要求1所述的小鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤（1）所选ICR小鼠为3~4周龄，体重30~35g。

4.根据权利要求1所述的小鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤（4）所用的冲洗骨髓的培养基含1%的双抗（100u/ml的青霉素，100u/ml的链霉素）。

5.根据权利要求1所述的小鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤（5）所用的percoll分离液比重为1.073~1.082g/ml。

6.根据权利要求1所述的小鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤（5）所用的密度梯度法离心速度为350~400g，离心时间20~30min。

7.根据权利要求1所述的小鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤（8）所述的完全培养基为含10%胎牛血清、100u/ml青霉素和100u/ml链霉素的双抗、4~6μg/ml胰岛素的L-DMEM培养基，pH为7.4。

8.根据权利要求1所述的小鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养方法，其特征在于步骤（8）所述的培养瓶用3~4μg/cm²的多聚赖氨酸包被，培养条件为37℃、5%CO₂培养箱。