[发明专利]环状RNA circ-GPC3及其检测试剂与应用

说明书

本发明涉及一种环状RNA circ‑GPC3及其检测试剂与应用，属于生物技术领域。本发明的环状RNA circ‑GPC3对应的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示，所述环状RNA circ‑GPC3由GPC3母基因的第3个独立外显子反向拼接环化产生；本发明环状RNA circ‑GPC3的检测引物如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；本发明环状RNA circ‑GPC3的检测探针如SEQ ID NO:4所示，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。本发明提供了一种新的环状RNA分子—环状RNA circ‑GPC3，并以该环状RNA circ‑GPC3作为分子标志物诊断肝癌。本发明还设计针对环状RNA circ‑GPC3分子的荧光定量检测引物及taqman探针，该探针和引物能很好的检测生物体内的circ‑GPC3表达情况，可以为肝癌的诊断提供一种基于环状RNA检测的方案。

技术领域

本发明涉及一种环状RNA circ-GPC3及其检测试剂与应用，具体涉及一种环状RNAcirc-GPC3、其检测引物和探针以及该环状RNA circ-GPC3在肝癌诊断中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

环状RNA(circRNA)是一类在生物体内存在的闭合的环状RNA分子，具有多种生物学特性，而且是客观大量存在的。环状RNA由基因组DNA转录加工后反向拼接产生的一类新颖的核酸分子。对于环化RNA的具体功能机制尚未明确，但在生物体内环状RNA可以多层次调控基因的表达，比如：环状RNA可以通过海绵作用吸附miRNA，转录后调控基因表达；环状RNA可以和RNA结合蛋白作用调控基因转录；环状RNA可以和基因组DNA结合调控RNA的剪接；另外环状RNA可以直接作为模板翻译蛋白质发挥重要的生物学作用。

Glypican3(GPC3)是一种硫酸乙酰肝素糖蛋白，全长蛋白位于细胞膜上。人的GPC3基因位于X染色体长臂26.2区域，全长基因组DNA跨越450151bp；最长转录RNA变异体包含9个外显子。GPC3的核酸及蛋白在肝、心、脑、脾、胃、小肠、大肠及胰腺等正常成人组织中均不表达或超微量表达，而在胎盘、胚胎肝、胚胎肺和胚胎肾中表达。1997年Hsu等报道GPC3mRNA在肝癌组织中特异性高表达，在非肿瘤性肝脏中不表达或极低表达。GPC3作为一种分泌型的糖基磷脂酰肌醇锚定膜蛋白，在原发性肝癌患者的血清中可以被检测到，而在肝硬化、慢性肝炎以及正常人群的血清中则无法检测到，GPC3的存在并不受到AFP的影响，在AFP阴性或阳性的肝癌患者的血清中均能够检测到GPC3的存在。GPC3基因和肝癌的发生发展有密切关系，研究认为GPC3是肝癌发生过程中的一个早期事件，参与调控肝癌的发展过程；GPC3可以与Wnt通途信号分子形成复合物，通过自分泌和旁分泌的方式来增加经典Wnt途径中的信号分子的表达，促进肝癌细胞的生长。

然而，现有技术暂无关于环状RNA circ-GPC3的研究。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种环状RNA circ-GPC3及其检测试剂与应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

第一方面，本发明提供了一种环状RNA circ-GPC3，所述环状RNA circ-GPC3对应的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示，所述环状RNA circ-GPC3由GPC3母基因的第3个独立外显子反向拼接环化产生。

本发明的环状RNA circ-GPC3是申请人检索环状RNA数据库circbase及设计反向扩增PCR引物，经过大量研究，在肝癌细胞系Huh7中识别鉴定的一个新型的环状RNA分子。环状RNA circ-GPC3是由GPC3基因的第3个独立完整的外显子首位相接连接而成的环状RNA分子，申请人将其命名为circ-GPC3，成熟circ-GPC3序列的长度为695nt。

第二方面，本发明提供了上述环状RNA circ-GPC3作为分子标志物在制备用于诊断肝癌的试剂盒中的应用。