[发明专利]一种石榴苯丙氨酸解氨酶PAL及其表达基因与应用

说明书

本发明涉及一种石榴苯丙氨酸解氨酶PAL及其表达基因与应用。一种石榴苯丙氨酸解氨酶PAL的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的石榴苯丙氨酸解氨酶PAL，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明采用RT‑PCR和RACE技术，从石榴果实中克隆苯丙氨酸解氨酶PAL的表达基因，进行生物信息学分析，并研究了其在不同品种果实发育中的表达特性，为揭示石榴果实外观品质和褐变形成的机理提供理论依据。

技术领域

本发明涉及一种石榴苯丙氨酸解氨酶PAL及其表达基因与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

苯丙烷途径是植物特有的次生代谢途径之一，能代谢成木质素、类黄酮、生物碱等生物活性物质。苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase，PAL，E.C 4.3.1.5)是苯丙烷代谢第一步反应的限速酶，能催化L-苯丙氨酸(L-phenylalanine，L-Phe)脱氨生成肉桂酸，是连接初级代谢和苯丙烷类代谢的关键桥梁^[1-2]。PAL不仅与植物抗病抗逆有关^[3]，还参与花青苷和木质素的合成，影响果实外观品质和组织褐变^[4]。

石榴(Punica granatum L.)果实富含安石榴苷、类黄酮和生物碱等生物活性物质，具有诸多保健功能，极具发展前景^[5]。石榴果实呈色受PAL、查尔酮合成酶(Chalconesynthase， CHS)、查尔酮异构酶(Chalcone isomerase，CHI)、二氢黄酮醇还原酶(Dihydroflavonol 4-reductase，DFR)和UDP-葡萄糖-类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶(UDP-glucose-flavonoid 3-O-glucosyltransferase，UFGT)等的调控，石榴果实中花青苷调控酶CHS、CHI、DFR和 UFGT基因克隆与表达方面的研究^[6]已有相关报道，但石榴果实呈色与PAL基因表达关系方面的研究还未有研究。石榴果实采后极易发生褐变，影响其商品价值。研究表明，石榴果实褐变程度与PAL活性高低密切相关^[7]，但PAL基因表达与石榴果实褐变的关系尚不清楚。因此，研究PAL在石榴果实发育期的表达水平对阐明石榴外观品质形成和褐变发生的分子机理具有重要价值。

迄今，鸭梨、柑橘、芒果等多种果树作物上已有PAL基因克隆和序列分析等方面的报道。在大多数植物中，PAL是由一个基因家族控制的，不同组织有多种同工酶，不同成员间表达特性不同^[8]。PAL在甘蔗根中相对表达量最高，在茎和叶中较低^[9]。‘鸭梨’果实发育早期果心中PbPAL1和PbPAL2表达量显著高于果皮和果肉，受机械损伤后，果皮和果肉中PbPAL1 和PbPAL2表达上调的时间不同^[2]。目前，石榴果实中PAL基因克隆、生物信息学及表达分析方面的研究国内外还未见报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种石榴苯丙氨酸解氨酶PAL及其表达基因与应用。石榴果皮RNA提取纯度低，易降解，存在基因全长克隆难等问题，本发明建立了一种石榴果皮PAL同源克隆方法，提供了一种石榴PAL核苷酸序列及其编码的蛋白序列，公开了PAL在不同石榴品种发育期的表达模式，为揭示石榴果实呈色和褐变机理提供了理论依据，具有一定的应用价值。

本发明技术方案如下：

一种石榴苯丙氨酸解氨酶PAL的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述石榴苯丙氨酸解氨酶PAL，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种重组载体，该表达载体包含有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的石榴苯丙氨酸解氨酶PAL的表达基因。

一种重组细胞，该重组细胞包含有上述重组表达载体或表达上述石榴苯丙氨酸解氨酶 PAL。