[发明专利]实现两个基因等量表达的基因元件及表达载体

说明书

本发明涉及实现两个基因等量表达的基因元件及表达载体，基因元件为Ck，或由Ck与2A裂解肽组成；所述2A裂解肽核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示；所述Ck的核苷酸序列SEQ ID NO.39所示，含有该元件的载体能够等量地重组表达位于两端的基因，对实现家蚕多基因表达具有重要意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及实现两个基因等量表达的基因元件，还涉及包含该元件的表达载体。

背景技术

在家蚕体内高效地重组表达多个基因可以推动家蚕的基础与应用研究，例如研究多个基因之间的相互关系、重组表达多亚基蛋白复合物的基因、与荧光蛋白同时表达可视化地研究靶标基因在体内的移动以及培育能够抗家蚕质型多角体病毒与核型多角体病毒的家蚕品种等。得益于2000年家蚕转基因操作体系的建立，此前，在家蚕体内同时表达多个基因主要是通过遗传杂交来实现的。首先，必须先建立多个单一表达靶标基因的转基因家蚕品系，再杂交，最后在杂交后代中筛选同时表达多个外源基因的家蚕个体。例如2006年，Takahiro Adachi等人成功将家蚕脯酰羟基酶β-亚基与人胶原蛋白同时表达在家蚕后部丝腺；2009年，Masashi Iizuka等人同时表达了鼠单克隆抗体的轻链基因与重链基因，将完整的鼠单克隆抗体表达在了家蚕茧壳；2015年，Minoru Tada等人还利用Gal4/UAS系统，采用两轮杂交的方式在家蚕中部丝腺中重组表达了anti-CD20单克隆抗体。该方法不仅耗时长，而且杂交过程比较繁琐。

2A裂解肽是一个在1991年于口蹄疫病毒中发现的、存在于两个蛋白(2A、2B)之间的寡肽，通常还有19-22个氨基酸。当核糖体到达2A的C端最后两个氨基酸甘氨酸与脯氨酸时，由于核糖体酰胺中心内部结构的改变导致无法翻译下游基因，此时，上游初生肽被水解释放出核糖体，然后核糖体再翻译下游基因，理论上可以实现两个基因的等量表达。目前，2A已经在多个细胞系、物种(小鼠，斑马鱼，猪，果蝇和羊种)中成功共表达了多个基因组合，应用于治疗癌症和其他疾病，或遗传改良具有特定功能或抗性植物和动物新品种。因此，前期研究中，我们也利用来至于猪肠病毒的P2A构建了家蚕丝腺2A多基因表达系统，但是，该系统并不能等量地重组表达位于2A上下游的DsRed基因与EGFP基因。

Kozak序列(Kozak consensus sequence)是位于真核生物mRNA 5’端帽子结构后面的一段核酸序列，通常是GCCACCAUGG，它可以与翻译起始因子结合而介导含有5’帽子结构的mRNA翻译起始。1981年，女科学家KOZAK在研究真核生物中起始密码子AUG周边碱基定点突变后对靶标基因的转录和翻译所造成的影响时，首先总结出在真核生物中，起始密码子两端序列为：-G/N-C/N-C/N-ANNAUGG-，如GCCACCAUGG、GCCAUGAUGG时，转录和翻译效率最高，特别是-3位的A、+4位的G对翻译效率非常重要。目前，诸多研究者也相继报道Kozak序列可以影响基因的表达水平。例如，2014年，通过将WNT16基因上游的调节序列(GCACCC)优化成为kozak序列(GCCACC)后，其表达量被提高了3.7倍，另外，GATA4基因上游Kozak序列-6位的G突变成C后，GATA4基因的表达量就被严重下调。

但是将Kozak序列用于优化家蚕丝腺中2A多基因表达系统，使其能够等量地重组表达位于2A两端的基因未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供实现两个基因等量表达的基因元件；本发明的目的之二在于提供含有所述基因元件的多基因表达载体。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

实现两个基因等量表达的基于2A裂解肽的基因元件，所述基因元件为Ck，或由Ck与2A裂解肽组成；所述2A裂解肽核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示；所述Ck的核苷酸序列SEQID NO.39所示。