[发明专利]一种德保黑猪手工克隆重构胚胎体外发育的药物及应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种德保黑猪手工克隆重构胚胎体外发育的药物及应用，对供体成纤维细胞进行5‑Aza‑CdR处理72h后发现，适宜浓度(0.25μmol/L～0.5μmol/L)的5‑Aza‑CdR可以降低供体核成纤维细胞的甲基化水平，并且提高了囊胚发育率和囊胚总细胞数，分别用不同浓度和不同时间5‑Aza‑CdR处理重构胚，统计其卵裂率、囊胚率以及囊胚细胞数，结果发现20nmol/L，72h为最佳处理条件。分析由于在相继对供体和重构胚进行处理后，5‑Aza‑CdR本身的药物残留及其细胞毒性会在重构胚上表现出叠加的作用，确定了分析方法以期达到最佳效果。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种德保黑猪手工克隆重构胚胎体外发育的药物及应用。

背景技术

目前，体细胞核移植(SCNT)技术与基因组学修饰技术的有机结合，为转基因动物的生产、人类基因疾病的动物模型的研制、异种器官移植等基础生物学的研究提供了强有力的技术支撑。由于猪在解剖、组织、生理、营养代谢等方面与人类非常相似，所以被认为是人类异种器官核移植最理想的供者，于是国内外的科学家纷纷将眼光聚焦于SCNT技术与基因组修饰技术的结合。由于大家畜尤其是猪的克隆效率依然很低(1％～2％)，极大地制约了体细胞克隆猪和转基因克隆猪相关研究工作的开展。影响体细胞克隆重构胚早期发育效果的因素有很多，比如供体细胞与受体细胞生长周期的协调，核质融合的过程，以及发育到8-cell阶段后能否顺利完成核质互换，以及重构胚的DNA甲基化与去甲基化水平等均影响到体细胞核移植重构胚的正常发育。对供体细胞和重构胚进行表观遗传修饰处理可以提高核移植胚胎的发育潜能。DNA甲基转移酶抑制剂是广泛运用于体细胞中的表观遗传修饰因子，它的甲基化和去甲基化在SCNT中，对供体与受体基因组重编程具有决定性作用。5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-2′-deoxycytidine，5-Aza-CdR)是不可逆的DNA甲基转移酶抑制剂，具有低剂量激活甲基化沉默基因、高剂量致细胞毒性的双重效应。它已通过美国FDA认证，是临床上常用的抗癌药物之一，同时其作为DNA甲基化酶抑制剂被人们所运用。表明用5-Aza-CdR处理供体细胞能够提高牛核移植胚胎在体外发育的潜能。但高浓度的5-Aza-CdR也已经被证实对牛核移植胚胎具有细胞毒性，而低浓度的5-Aza-CdR处理供体细胞有益于猪克隆胚胎的发育。通过研究首先利用5-Aza-CdR处理成纤维细胞供体后发现，高剂量5-Aza-CdR可以降低供体细胞和重构胚的DNA甲基化水平，但对胚胎的发育却有阻碍作用，后来发现低剂量可以达到降低甲基化水平同时提高囊胚发育的目的。5-Aza-CdR处理德保黑猪HMC重构胚，传统的分析方法无法确定5-Aza-CdR的配比浓度，无法了解其对重构胚体外发育潜能的影响。

综上所述，现有技术存在的问题是：5-Aza-CdR处理德保黑猪HMC重构胚，传统的分析方法无法确定5-Aza-CdR的配比浓度；若5-Aza-CdR剂量过高可以降低供体细胞和重构胚的DNA甲基化水平，但对胚胎的发育却有阻碍作用，分析方法无法了解其对重构胚体外发育潜能的影响。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种德保黑猪手工克隆重构胚胎体外发育的药物及应用，

本发明是这样实现的，一种德保黑猪手工克隆重构胚胎体外发育的药物，所述德保黑猪手工克隆重构胚胎体外发育的药物为5-氮杂-2′-脱氧胞苷；

所述5-氮杂-2′-脱氧胞苷浓度0.25μmol/L～0.5μmol/L；处理72h。

进一步，所述5-氮杂-2′-脱氧胞苷的浓度为20nmol/L，处理72h。

本发明的另一目的在于提供一种所述德保黑猪手工克隆重构胚胎体外发育的药物在德保黑猪养殖中的应用。