[发明专利]检测CD19 CAR的细胞的方法及其应用

说明书

本发明提供了一种检测CD19 CAR阳性细胞的方法及其应用。具体地，本发明提供了一种用于检测CD19 CAR阳性细胞的检测试剂，所述检测试剂包括：(a)第一检测试剂，所述第一检测试剂是第一抗体，所述第一抗体为多克隆抗体，并且所述多克隆抗体特异性结合于CD19 CAR的胞外的抗原结合域；和(b)第二检测试剂，所述第二检测试剂特异性结合于第一抗体或偶联于第一抗体的标记物。本发明的检测试剂和方法灵敏度高、特异性好、检测结果更为准确性。

技术领域

本发明属于生物技术和医学领域，具体涉及一种检测表达CD19 CAR的细胞的方法及其应用。

背景技术

随着肿瘤免疫治疗的发展，结合了抗体和免疫细胞优势的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)-T细胞免疫治疗受到极大关注。

CAR主要由细胞膜外抗原结合区和细胞内信号转导区通过铰链区及跨膜区构成。膜外抗原结合区具有特异性识别并结合靶细胞表面抗原的功能，其构成源于单克隆抗体的单链可变区结构域(Single Chain Variable Fragment，scFv)，由重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)组成。细胞内信号转导区主要由共刺激信号和T细胞受体(TCR)的CD3zeta链组成。表达CAR的T细胞(CAR-T)通过scFv与靶细胞抗原结合后，胞内信号转导区将信号传入T细胞，从而激活T细胞，分泌穿孔素、颗粒酶及细胞因子等，发挥杀伤作用。

目前FDA批准上市了两款CAR-T细胞药物，分别是诺华制药(Novartis)的Kymriah，和吉利德公司(Gi lead)的Yescarta。两款药物均针对CD19阳性B细胞肿瘤，采用了相同的抗原结合区，即来源于鼠单克隆抗体FMC63的scFv。

构建CAR-T细胞需要将CAR基因通过病毒或非病毒系统转染并整合到T细胞基因组上。当该基因正常表达，在细胞膜上形成跨膜的CAR结构时，CAR-T细胞才具有识别和杀伤靶细胞的活性。因此，准确检测表达CAR的阳性T细胞是CAR-T药物质量控制的关键步骤，也是临床上对病人治疗剂量控制、过程监控及伴随诊断的重要环节。

常见的对于CAR-T细胞进行检测的方法有两种类型：检测CAR基因阳性T细胞和检测CAR蛋白阳性T细胞。

对于检测CAR基因阳性T细胞而言，定量实时聚合酶联反应(Quantitative RealTime PCR,qPCR)是检测CAR基因阳性T细胞的主要方法。通过qPCR可以检测细胞基因组上整合的CAR基因，以及CAR基因的拷贝数。但该方法不能准确反映表达CAR的阳性T细胞，因为有一部分整合了CAR基因的T细胞没有正常表达CAR(Jennifer N.Brudno,et al.,Journal ofClinical Oncology,2016)，这些T细胞带来的假阳性降低了qPCR方法应用的准确性。此外，qPCR方法无法满足对T细胞多种表面标志物(CD3、CD4、CD8等等)同时检测的需求，这进一步限制了qPCR方法的应用。