[发明专利]一种重组Vip3 Aa蛋白的制备方法及其应用

说明书

本发明涉及一种重组Vip3 Aa蛋白的制备方法及其应用，属于生物防治领域。本发明所述的重组Vip3 Aa蛋白的制备方法通过将Vip3 Aa DNA进行PCR反应后，然后使用限制性内切酶BamH I和Xho I进行双酶切得到目的基因并与pET21b连接得到Vip3 Aa/pET21b表达载体，将载体转入E.coil BL21感受态细胞得到重组菌株，重组菌株生长至对数生长期后加入IPTG诱导表达制备得到Vip3 Aa蛋白，该蛋白对于德国小蠊和美洲大蠊具有很好的生物防治效果，适合在农业上推广应用。

技术领域

本发明涉及一种重组Vip3 Aa蛋白的制备方法及其应用，具体涉及一种诱导表达Vip3 Aa/pET21b/BL21重组菌株制备Vip3 Aa蛋白及其在德国小蠊和美洲大蠊防治中应用，属于生物防治领域。

背景技术

Bt菌株可以在营养生长阶段合成一种杀虫蛋白，杀虫蛋白被称为营养性杀虫蛋白(vegetative insecticidal proteins，Vip)。Vips主要分为vip1，vip2和vip3，不同的vips蛋白具有不同的杀虫活性。Vip3蛋白是目前研究最多的Vip蛋白。Vip3 Aa蛋白对棉铃虫、甜菜夜蛾、草地贪夜蛾、烟夜蛾、小菜蛾、斜纹夜蛾和小地老虎等农作物害虫具有较高的杀虫活性。作用过程为：Vip3蛋白被中肠蛋白酶水解为活性蛋白，活性蛋白与上皮中肠细胞顶端特异性受体结合，形成孔道并破坏中肠细胞，导致昆虫死亡。Vip3 Aa蛋白通过激发凋亡类型的细胞程序性死亡对敏感性昆虫具有毒杀效应。Vip3 Aa蛋白在昆虫肠道内被水解为4种主要蛋白产物，其中只有一种蛋白水解产物(62KD)为Vip3 Aa蛋白的毒性核心结构。Vip3Aa蛋白结合敏感昆虫的中肠上皮细胞，启动细胞程序性死亡，造成中肠上皮细胞的溶解导致昆虫死亡。对非敏感昆虫不产生任何病症，不会导致中肠上皮细胞的凋亡和溶解。

美洲大蠊和德国小蠊在全世界广泛分布的害虫，其可携带和传播多种疾病，如鼠疫杆菌、痢疾杆菌、大肠杆菌和脊椎灰质炎病毒等40多种病原体。目前，蜚蠊科昆虫的主要防治方法可分为物理防治、化学防治和生物防治。化学防治是使用最广泛的方法。化学杀虫剂可以在人体和动物器官和脂肪中积累，引起慢性中毒，同时蜚蠊对杀虫剂的抗性增强影响了化学杀虫剂的进一步使用。使用生物杀虫剂及其代谢物代替化学杀虫剂来预防蜚蠊是潜在的有希望的方法，如商业性绿僵菌杀虫剂(Biopath)已经可用于预治蜚蠊，武汉大学开发了一种病毒杀虫剂用于蟑螂的防治。

中国专利申请2011104173078公开了一株对蔬菜鳞翅目害虫具有广谱高毒力的苏云金芽胞杆菌MB-15(BacillusthuringiensisMB-15)，菌株保藏号为CGMCC№.5255。该菌株能形成菱形杀虫晶体蛋白，含有cry1I、cry1Ac、cry2Ac和Vip3Aa四种基因，对小菜蛾、菜粉蝶、甜菜夜蛾、斜纹夜蛾、棉铃虫等鳞翅目害虫具有高效的杀虫活性。

中国专利申请2013102898486涉及一种杀虫基因及其用途，所述杀虫基因的核苷酸序列包括：(a)具有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；或(b)与(a)的核苷酸序列同类编码，且不为SEQ ID NO：22；或(c)在严格条件下与(a)或(b)限定的核苷酸序列杂交且编码具有杀虫活性的蛋白质的核苷酸序列。本发明杀虫基因特别适合在单子叶植物中表达，显著提高了Vip3 Aa-02杀虫蛋白的表达量、稳定性和毒力；同时本发明通过植物体内产生能够杀死大螟的Vip3 Aa蛋白来控制大螟害虫，对植物进行全生育期、全植株的保护以防治大螟害虫的侵害。经过检索，目前尚未见Vip3 Aa蛋白蟑螂防治中的应用报道。

发明内容

本发明的目的之一在于提供重组Vip3 Aa蛋白的制备方法。

一种重组Vip3 Aa蛋白的制备方法，其具体包括下述步骤：

1)Vip3 Aa基因的克隆及双酶切重组质粒的构建