[发明专利]嗜热子囊菌基因表达系统

说明书

本发明提供一种嗜热子囊菌乳清酸核苷‑5’‑磷酸脱羧酶基因(pyrG)缺陷型菌株，其保藏号为CGMCC.13375。本发明还提供包含所述缺陷型菌株的嗜热子囊菌基因表达系统以及相应的目的基因的转化和表达方法，以及编码与所述pyrG缺陷型菌株相对应的乳清酸核苷‑5’‑磷酸脱羧酶的分离的核酸。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，本发明涉及通过紫外诱变方法，筛选出一株乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)突变的尿嘧啶营养缺陷型的嗜热子囊菌菌株，并且涉及利用所述菌株的嗜热子囊菌基因表达系统。

背景技术

嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)是子囊菌类的耐热真菌。最早于1907年由Hugo Miehe在自发生热的干草垛中分离得到。嗜热子囊菌的孢子呈亮橘黄色椭球形，一般认为没有无性繁殖阶段。报导的嗜热子囊菌孢子萌发的最佳和最高温度分别为47.5℃和60℃左右。相应的菌丝生长的最适和最高温度则较低，分别在40-45℃和55℃。孢子萌发和菌丝生长的下限温度则分别为32.5℃-35℃和20℃-25℃。另外孢子萌发率会受菌株培养年龄的些微影响。

嗜热子囊菌是一种能够高表达耐热纤维素酶的子囊菌纲真菌，可以生产一大批工业上有应用价值的酶类。这些耐热酶出色的高温稳定性和变性剂耐受性赋予其很好的工业潜力。而且嗜热子囊菌在以源自农林业废弃物，木质纤维素类生物质为基础的培养条件下可有效生长。在此类低成本的常见材料上的出色适应性使其在工业上生产纤维素酶时具有重大优势。在木质纤维素类生物质精炼方面，相对于化学转化在温度压力要求上也都温和许多。耐热酶因其在工业条件下的应用优势：(1)大量转化反应可以在更高温度下进行以降低体系粘度；(2)污染风险降低；(3)酶可以在室温有效保存而不失活。但是由于特异培养的生长速率低，大量生产商用耐热生物酶仍旧是一个经济上的挑战。所以要充分发掘它的生物技术潜能，特别是在分子和基因层面上，还有很多工作需要完成。其中很重要的一个障碍就是嗜热子囊菌还没有建立转化和遗传操作系统。因此建立一个有效的丝状真菌遗传操作系统具有重要价值。

当前丝状真菌中使用的转化方法主要有：⑴原生质体-PEG转化法；⑵农杆菌介导的转化；⑶电击转化法；⑷醋酸锂转化法；⑸脂质体转化法；⑹基因枪法等(Dhawale等1984,Chakraborty等1991,Hazell等2000,Michielse等2008,Yin等2012,Chai等2013)。

若要进一步开发嗜热子囊菌的工业潜力，在分子和遗传方面还有许多工作要做。但是该菌种始终没有有效可用的遗传操作系统。本发明通过紫外诱变的方法构建了稳定遗传的嗜热子囊菌pyrG缺陷型菌株。使用蜗牛酶处理菌丝成功地获得了具有再生活力的原生质体，克隆了可作为选择标签的该菌自身的pyrG基因、纤维二糖水解酶和内切葡萄糖苷酶的启动子，并成功的建立了嗜热子囊菌的高效转化系统并表达了外源基因。

发明内容

本发明目的是为了在嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)中构建一个外源基因的表达系统，这个系统包括宿主菌乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)突变的尿嘧啶营养缺陷型菌株TA3(于2016年12月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号：CGMCC.13375)，外源基因在该菌株的原生质体-PEG转化方法，转化子的筛选方法，即利用克隆得到的pyrG基因作为选择标签转化入该诱变株使得其恢复合成尿嘧啶的能力来筛选转化子。构建了外源基因表达的质粒及启动子系统。

本发明成功得到一株乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG)突变的尿嘧啶营养缺陷型菌株作为宿主菌，克隆了对应的pyrG基因作为转化的选择标签，克隆了纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶的启动子用于表达外源基因，并且建立了基因转化方法，通过淀粉酶AoAMY基因的重组表达验证了该转化系统及表达外源基因的有效性。