[发明专利]鲤科鱼类线粒体基因组全序列扩增引物及扩增方法

权利要求书

1.一种鲤科鱼类全基因组序列的扩增引物，其特征是：包括用于扩增鲤科鱼类线粒体基因组三个长片段中片段1的外引物和内引物各一对，用于扩增鲤科鱼类线粒体基因组三个长片段中片段2的外引物和内引物各一对，用于扩增鲤科鱼类线粒体基因组三个长片段中片段3的外引物和内引物各一对，以及一对测序引物，具体如下：

(1)用于扩增鲤科鱼类线粒体基因组片段1的外引物包括：

正向引物为Li1-F1，其序列如SEQ ID NO：1所示；

反向引物为Li1-R1，其序列如SEQ ID NO：2所示；

(2)用于扩增鲤科鱼类线粒体基因组片段1的内引物包括：

正向引物为Li1-F2，其序列如SEQ ID NO：3所示；

反向引物为Li1-R2，其序列如SEQ ID NO：4所示；

(3)用于扩增鲤科鱼类线粒体基因组片段2的外引物包括：

正向引物为Li2-F1，其序列如SEQ ID NO：5所示；

反向引物为Li2-R1，其序列如SEQ ID NO：6所示；

(4)用于扩增鲤科鱼类线粒体基因组片段2的内引物包括：

正向引物为Li2-F2，其序列如SEQ ID NO：7所示；

反向引物为Li2-R2，其序列如SEQ ID NO：8所示；

(5)用于扩增鲤科鱼类线粒体基因组片段3的外引物包括：

正向引物为Li3-F1，其序列如SEQ ID NO：9所示；

反向引物为Li3-R1，其序列如SEQ ID NO：10所示；

(6)用于扩增鲤科鱼类线粒体基因组片段3的内引物包括：

正向引物为Li3-F2，其序列如SEQ ID NO：11所示；

反向引物为Li3-R2，其序列如SEQ ID NO：12所示；

(7)鲤科鱼类线粒体基因组片段测序引物包括：

正向引物为Li-ceF，其序列如SEQ ID NO：13所示；

反向引物为Li-ceR，其序列如SEQ ID NO：14所示；

其中序列中的r为简并碱基，代表a和g的混合碱基位点；序列中的y为简并碱基，代表c和t的混合碱基位点；序列中的k为简并碱基，代表g和t的混合碱基位点；序列中的n为简并碱基，代表a、c、g和t的混合碱基位点；序列中的b为简并碱基，代表c、g和t的混合碱基位点。

2.一种鲤科鱼类线粒体全基因组的扩增方法，其特征是包括以下步骤：

(1)选取鲤科鱼类，提取其全基因组DNA，以全基因组DNA为模板，用外引物进行第一轮PCR扩增，获得长度较长的PCR产物；

(2)然后以第一轮PCR产物为模板，用内引物进行第二轮PCR扩增，获得长度较短的目标基因片段；

(3)对第二轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目标片段，利用鲤科鱼类线粒体基因组片段序列测序引物进行序列测定；

步骤(1)中所述外引物为权利要求1中的用于扩增鲤科鱼类线粒体基因组片段1的外引物、用于扩增鲤科鱼类线粒体基因组片段2的外引物和用于扩增鲤科鱼类线粒体基因组片段3的外引物；步骤(2)中所述的内引物为权利要求1中的用于扩增鲤科鱼类线粒体基因组片段1的内引物、用于扩增鲤科鱼类线粒体基因组片段2的内引物和用于扩增鲤科鱼类线粒体基因组片段3的内引物。

3.根据权利要求2所述的鲤科鱼类线粒体全基因组的扩增方法，其特征是：步骤(1)中第一轮PCR扩增时反应体系的总体积为25μL，其中10×Trans Taq buffer I 2.5μL，浓度为2.5mM的dNTPs 2.0μL，浓度为10μM的正反引物各1.0μL，长片段扩增Taq酶0.5μL，DNA模板1μL，ddH 2 O 17.0μL。

4.根据权利要求2所述的鲤科鱼类线粒体全基因组的扩增方法，其特征是：步骤(1)中第一轮PCR扩增反应条件为：94℃预变性1min；94℃变性30s，45～55℃退火30s，72℃延伸7min，30个循环；最后72℃延伸10min。