[发明专利]一种蓖麻遗传转化方法

权利要求书

1.一种蓖麻遗传转化方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)制备转化受体

蓖麻种子的灭菌：剥掉蓖麻种皮，在锥形瓶中用75％的乙醇灭菌5min，之后用15％的过氧化氢于摇床100rpm震荡处理15min，最后用无菌水清洗5次；

预培养：取种子的白色胚乳，放置于Rc1培养基中，暗处培养5天至生根发芽，将根和子叶部分切掉后放置于Rc2培养基中，再将Rc2培养基放在超净工作台上，光照培养3-7天，至外植体变粗变绿；

2)制备侵染液

取20ml Rc-inf，依次加入20μl AS、10μl DTT、10μl Na2SO3，将农杆菌挑至混合液中，制成侵染液；

3)侵染

将Rc2培养基中的蓖麻放置于超净工作台中，用刀在外植体原两片子叶打开的地方切一下，刀口不超过0.2cm，取50ml的灭菌三角瓶，向其中倒入Rc-inf，没过瓶底即可，将切好的外植体放入三角瓶中，再将步骤2)制备的侵染液加至三角瓶中，于摇床100rpm侵染15min，之后取出置于无菌滤纸上吹20min；

4)共培养

将步骤3)吹至表面无液体的外植体接至放有灭菌滤纸的Rc-cocu培养基上，暗处培养3天；

5)恢复培养

将共培养后的外植体取出放置于灭菌皿中，观察切痕处是否变黑，变黑即放入Rc-reco培养基中恢复培养5～10天，当外植体变粗并长出绿色叶子时将其转接入筛选培养基；

6)筛选

将恢复培养完毕的外植体放入筛选培养基Rc3-Bas2中筛选，筛选过程一次10天，筛选2-3次，至外植体逐渐膨大并在顶端长出新芽，得到转化外植体；

7)伸长、生根培养

将转化外植体放置于Rc3培养基中进行伸长，伸长过程一次10天，伸长2-4次；

将伸长至2～3cm的小苗取出，切掉底部愈伤化或黑化部分，再接入Rc4培养基进行生根；

各步骤中用到的培养基具体配方见下表：

上述培养基配方表中的各个代码代表含义为：

2.如权利要求1所述的蓖麻遗传转化方法，其特征在于，所述步骤1)中通过如下方法得到胚乳：夹住剥掉种皮的蓖麻种子有黑点的一端，纵向从一半处切至种子的中心位置，再横向切开，可观察到一白色胚乳，用刀挑出。

3.如权利要求1所述的蓖麻遗传转化方法，其特征在于，所述步骤2)中制备的侵染液OD₆₀₀＝0.8～1.0。

4.如权利要求1所述的蓖麻遗传转化方法，其特征在于，选用的农杆菌为EHA105，农杆菌携带的抗性基因为卡纳抗性基因，转基因载体骨架为pCAMBIA3301，转基因植株筛选标记为草铵膦。

5.如权利要求1所述的蓖麻遗传转化方法，其特征在于，所述步骤5)恢复培养和步骤6)筛选过程中，每个培养皿中接入外植体均遵循3-4-4-3原则，共接入14个外植体。