[发明专利]一种鹦鹉喙羽病病毒PCR诊断试剂盒及其检测方法

说明书

本发明公开了一种鹦鹉喙羽病病毒PCR诊断试剂盒及其检测方法，包括：裂解液、扩增反应混合液、阴性对照和阳性对照；其中，裂解液的成分为DNAiso Reagent；扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、PCR Buffer、dNTP、PBFDV‑F上游引物、PBFDV‑R下游引物和rTaq DNA聚合酶；阴性对照为灭菌三蒸水；阳性对照为PBFDV阳性质粒。该试剂盒针对鹦鹉喙羽症病毒设计了一对特异性引物，试剂盒的灵敏度高、特异性好、稳定性高、结果直观，其检测方法易于操作、方便快捷，能大幅缩短检测时间，降低诊断费用，为临床控制鹦鹉喙羽病病毒感染提供有力的技术手段，适用于鹦鹉喙羽症病毒病的快速诊断。

技术领域

本发明涉及动物医学动物疫病分子生物学诊断技术领域，具体涉及一种鹦鹉喙羽病病毒PCR诊断试剂盒及其检测方法。

背景技术

鹦鹉喙羽症的病原为鹦鹉喙羽病病毒(PBFDV)，主要引起鹦鹉鸟喙及羽毛病变，是一种高传染性病，发病急，死亡迅速。此疾病首先发现在1970年代中期的南太平洋鹦鹉，症状为羽毛不规则生长及脱落，鸟喙变形，最后因免疫力降低引发感染而死亡。后来又陆续在葵花鹦鹉、非洲灰鹦鹉、折衷鹦鹉、爱情鹦鹉、虎皮鹦鹉、亚马逊鹦鹉、金刚鹦鹉及小鹦哥发现PBFDV感染。

PBFDV属于圆环病毒科、圆环病毒属成员，为20面体对称病毒，基因组为环状单股DNA。PBFDV传播的途径主要是通过患鸟的血液、羽屑、粪便、嗉囊分泌物散播病毒，其中又以羽屑为最重要的散布来源，幼鸟免疫系统发育不成熟，所以容易受到感染。目前对PBFDV的诊断研究几乎是空白，本发明针对PBFDV基因设计了PCR诊断方法，并组装成试剂盒，是鹦鹉PBFDV感染最灵敏特异的诊断技术手段。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种鹦鹉喙羽病病毒PCR诊断试剂盒及其检测方法，该试剂盒针对鹦鹉喙羽症病毒设计了一对特异性引物，试剂盒的灵敏度高、特异性好、稳定性高、结果直观，其检测方法易于操作、方便快捷，能大幅缩短检测时间，降低诊断费用，为临床控制鹦鹉喙羽病病毒感染提供有力的技术手段，适用于鹦鹉喙羽症病毒病的快速诊断。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现。

(一)一种鹦鹉喙羽病病毒PCR诊断试剂盒，包括：裂解液、扩增反应混合液、阴性对照和阳性对照；其中，所述裂解液的成分为DNAiso Reagent；所述扩增反应混合液包含灭菌三蒸水、PCR Buffer、dNTP、PBFDV-F上游引物、PBFDV-R下游引物和rTaq DNA聚合酶；所述阴性对照为灭菌三蒸水；所述阳性对照为PBFDV阳性质粒。

优选的，所述PBDFV-F上游引物的序列为：5’-AGCGATTTGGATAATGAGAAGTA-3’；所述PBDFV-R下游引物的序列为：5’-CCCGGGGGGCCGTACACAACGT-3’。

优选的，所述裂解液成分为DNAiso Reagent，20个反应共计20mL，装成1瓶；所述扩增反应混合液包含：灭菌三蒸水、10×PCR Buffer、2.5mmol·L^-1dNTP、25μmol·L^-1PBFDV-F上游引物、25μmol·L^-1PBFDV-R下游引物和5U/μL rTaq DNA聚合酶，每个反应体积比为17.0︰2.5︰2︰0.5︰0.5︰0.5，共计23μL，20个反应共计460μL，装成1管；所述阴性对照为灭菌三蒸水，20个反应共计2.0mL，装成1瓶；所述阳性对照为PBFDV阳性质粒，20个反应共计40.0μL，装成1管。

(二)一种鹦鹉喙羽病病毒PCR诊断试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

步骤1，DNA提取