[发明专利]含有靶向DHCR24基因的干扰片段序列的重组腺病毒干扰载体及其降血脂中的应用

说明书

本发明提供含有靶向DHCR24基因的干扰片段序列的重组腺病毒干扰载体及其在降血脂中的应用。DHCR24是胆固醇内源性合成中最后一步的酶，重组腺病毒干扰载体Ad‑SiDHCR24能够靶向DHCR24基因，干扰其表达，从而降低细胞胆固醇的生物合成。本发明表明，Ad‑SiDHCR24在细胞和动物水平干扰其靶基因DHCR24的表达，不仅能够在细胞水平降低胆固醇，还能够在动物实验的小鼠高血脂模型中发挥显著的降血脂效果。

技术领域

本发明涉及含有靶向DHCR24基因的干扰片段序列的重组腺病毒干扰载体Ad-SiDHCR24，以及使用该重组腺病毒干扰载体制备防治高血脂疾病的药物中的应用。

背景技术

高血脂症状表现为血液中胆固醇、低密度脂蛋白固醇、甘油三酯水平高于正常值，而高密度脂蛋白固醇低于正常值，这些因子是动脉粥样硬化以及心血管疾病的重要风险评估因素。因此，降胆固醇一直是这一类疾病的主要治疗手段。

低密度脂蛋白(Low Density Lipoprotein，LDL)是一个独立的高血脂评估风险因素，LDL将肝脏或者肠道中的胆固醇运输到组织。由于LDL含有高水平的胆固醇，当血浆中LDL水平增加时，其可能在动脉壁堆积，导致冠状动脉疾病和心脏病发病风险增加。因此LDL被认为是“有害的胆固醇”。

他汀类药物是传统经典的降胆固醇药物，它是胆固醇合成过程中限速酶HMG-COA还原酶的抑制剂，通过阻断底物HMG-COA转化为甲羟戊酸途径从而降低胆固醇的合成。尽管他汀类药物已经在世界范围显示出降低心血管疾病发生的风险，但仍有一部分病人不能达到理想的LDL-C(LDL胆固醇)水平或者由于副作用而停止治疗。另一方面，传统的非他汀类药物如烟酸、胆酸螯合剂、贝特类药物和Ω-3脂肪酸由于缺乏强有力的降低心血管疾病的风险证据，其降血脂治疗广受争议。因此开发新型降胆固醇的药物需求仍然很迫切。

SiRNA(Small interfering RNA)是一种小RNA分子，由Dicer(RNAaseⅢ家族中对双链RNA具有特异性的活性核酸内切酶)加工而成。siRNA与之互补的目标mRNA结合，导致靶基因沉默。利用siRNA干扰其同源靶基因的理论，siRNA的互补DNA序列经常被用来当做工具或药物，通过干扰其同源基因下调其表达实现治疗某些疾病的目的。但是siRNA单独针对其靶基因的单一的RNA靶点序列，容易造成RNA干扰的脱靶效应。

体外制备siRNAs有三种方法，化学合成、体外转录和用RNaseIII消化长片段dsRNA制备siRNA。化学合成方法适用于已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究，但由于价格比较高和定制周期长，不适用于筛选siRNA等长时间的研究。体外转录方法以DNA Oligo为模版，通过体外转录合成siRNAs，成本相对化学合成法而言比较低，而且能够比化学合成法更快的得到siRNAs。此方法得到的siRNAs毒性小，稳定性好，效率高，只需要化学合成的siRNA量的1/10就可以达到化学合成siRNA所能达到的效果，从而使转染效率更高。不足之处是实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比，还是需要占用研究人员相当的时间。dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤，为研究人员节省时间和金钱。不过这种方法的缺点也很明显，就是有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因。