[发明专利]一种肝细胞miR-199b低表达的慢病毒表达载体及其构建方法

说明书

本发明提供一种肝细胞miR‑199b低表达的慢病毒表达载体，包括pLVX‑shRNA2‑puro病毒载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和tudmiRNA‑199b重组质粒；所述多克隆位点序列包括Hind III酶切位点和BamH I酶切位点，所述tudmiRNA‑199b重组质粒正向插入所述多克隆位点序列中。本发明属于基因工程技术领域，本发明提供的重组慢病毒表达载体具有转染效率高，用量少的优点，可在人源肝细胞中持续、高效、稳定地抑制miRNA‑199b表达。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种肝细胞miR-199b低表达的慢病毒表达载体及其构建方法。

背景技术

miRNA是一类进化保守的内源性的非编码小分子，普遍存在于多样性生物体内参与基因调控。miRNA主要调控着编码蛋白的基因表达，其作用机制是降解与其互补结合的mRNA 或抑制不完全配对的mRNA翻译，具有非常重要的生物学作用。

miRNA是在细胞核内DNA聚合酶Ⅱ作用下由DNA转录成为初级miRNA (pri-miRNA)。miRNA在核内酶RNaseⅢ-Drosha的作用下加工剪切为六七十个核苷酸序列的发夹结构前体pre-miRNA，然后再依赖RNA的核转运受体家族成员输出蛋白Exportin-5 的作用下转运到胞浆。在胞浆RNaseⅢDicer酶作用下二次加工为单链的成熟miRNA，与 RNA诱导沉默复合物结合形成RISC，识别靶mRNA后抑制其翻译或通过去腺苷酸化和脱帽作用致使mRNA降解。对miRNA进行tud(tough decoy)处理得到tudmiRNA，通常可以提高miRNA的抑制效果，但是实际应用中，由于tudmiRNA的结构较复杂，使表达tudmiRNA 的重组载体构建难度较大。

通过miRNA靶基因预测软件查找能与SET基因3’-UTR互补结合的miRNAs，包括miRNA-23a，miRNA-21,miRNA-199b,miRNA-20a,miRNA-29b，miRNA-194,miRNA-221, miRNA-129等。中国专利申请CN 105925613A公开了一种促进肝细胞miR-199b高表达的慢病毒表达载体及其构建方法，通过将含有绿色荧光基因的Pri-miRNA-199b序列产物与 pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro病毒载体连接得到的重组慢病毒表达载体具有转染效率高，可在肝细胞中持续、高效、稳定地提高miRNA-199b表达。

通过调节miRNA-199b表达，可能在制备治疗miRNA-199b表达异常相关疾病药物的开发中起到作用，但现有技术尚可稳定低表达miRNA-199b的重组载体。因此，提供一种肝细胞miR-199b低表达的慢病毒表达载体及其构建方法具有重要意义。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种肝细胞miR-199b低表达的慢病毒表达载体及其构建方法，从可能影响SET基因表达的众多miRNAs中筛选出miRNA-199b，通过tud 处理得到tudmiRNA-199b，引进Hind III和Bgl II特异性酶切位点后与pLVX-shRNA2表达载体重组得到tudmiRNA-199b重组质粒，再经Hind III和BamH I限制性内切酶进行双酶切后，与pLVX-shRNA2-puro病毒载体连接，得到可稳定低表达miR-199b的重组慢病毒表达载体，具有转染效率高，用量少的优点，可在人源肝细胞中持续、高效、稳定地抑制miRNA-199b 表达，实现稳定低表达miRNA-199b，进而对SET基因表达起到调控作用。

本发明提供一种肝细胞miR-199b低表达的慢病毒表达载体，包括pLVX-shRNA2-puro病毒载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和tudmiRNA-199b重组质粒；所述多克隆位点序列包括Hind III酶切位点和BamH I酶切位点，所述tudmiRNA-199b 重组质粒正向插入所述多克隆位点序列中。