[发明专利]一种热处理去除PCV2 VLPs中非VLPs蛋白的方法

说明书

本发明公开了一种热处理去除PCV2 VLPs样品clear E.coli BL21(DE3)/pET28a‑cap中非VLPs蛋白的方法。根据文献及专利调研，用硫酸铵沉淀方法初步制备PCV2 VLPs粗样品，对制备的PCV2 VLPs粗样品进行热处理，离心分离PCV2 VLPs粗样品热处理后的上清和沉淀，对处理前后PCV2 VLPs样品进行SDS‑PAGE检测、琼扩效价检测，并电镜观察处理前后的VLPs。通过本方法处理，在不损失PCV2 VLPs（琼扩效价不降低）的前提下去掉了PCV2 VLPs样品中大部分杂蛋白及部分未形成VLPs的目的蛋白（即非VLPs蛋白）。

技术领域：

本发明属于基因工程产品制备领域，具体涉及一种热处理去除PCV2 VLPs中非VLPs蛋白的方法。

背景技术:

猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning muLtisystemic wasting syndrome，PMWS）的主要病原，此外还与猪皮炎与肾病综合征、仔猪先天性震颤、流产和渗出性皮炎等有关，这些疾病统称为猪圆环病毒病。

目前，该病广泛流行于世界各地，在我国猪群中流行较为严重，临床上常与猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟和猪细小病毒等混合感染，继发感染，给养猪业造成了巨大的损失。目前，疫苗接种是防控PCV2的有效手段，国内外研发的商品化PCV2疫苗已陆续获得上市认可，主要包括全病毒灭活疫苗、重组病毒嵌合灭活疫苗和重组亚单位疫苗，这些疫苗的应用为PCV2感染的控制发挥了重要的作用。但强毒灭活不彻底或弱毒返祖可能导致免疫个体发病。尤其是那些容易产生遗传变异或重组的致弱病毒，变异或返祖的风险更大。在特定条件下，免疫个体能感染同一种病毒的不同血清型或变异株，遗传物质在宿主体内重新混合或者重组，最终产生新的病毒变异株。病毒样颗粒（Virus-like particles,VLPs）疫苗代表了一类特殊的基因工程亚单位疫苗，它有着与病毒粒子相似的天然结构，且容易制备高纯度和高效价的抗原。VLPs不携带病毒的任何DNA/RNA遗传物质，克服了全病毒灭活疫苗和全病毒弱毒活疫苗可能出现的散毒、重组以及变异的潜在可能性。VLPs疫苗因其具有安全、可靠、高效的优点，已成为PCV2亚单位疫苗研究的趋势。

迄今为止，人们已经研究出多种原核和真核表达系统用以生产基因工程疫苗。与其它系统相比，大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚、操作简便、培养周期短、可以大规模发酵培养、产量高、成本低等优点，是现阶段常用的表达系统，也是用于PCV2 VLPs疫苗生产的理想表达系统。同时，大肠杆菌表达、制备的PCV2 VLPs中也有内毒素残留、非VLPs蛋白等不利因素。现如今已有多种内毒素去除方法可以有效去除内毒素，将内毒素含量降至标准以内。因为PCV2单体蛋白上有衰减表位的存在，会大大降低疫苗的免疫效果，所以有必要除去PCV2 VLPs样品中的非VLPs蛋白。目前多采用离子交换、分子筛等层析方法或超速离心来纯化PCV2 VLPs，相对这些方法或耗时、或处理量小、或后期需要进一步浓缩等缺点，本研究开发了一种更为方便、快捷、简单、低成本的PCV2 VLPs样品中的非VLPs蛋白去除方法。

发明内容:

为提高PCV2 VLPs样品中VLPs纯度，降低因大量单体存在导致疫苗免疫效力下降，本发明提供一种热处理去除PCV2 VLPs中非VLPs蛋白，同时去除部分杂蛋白的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种热处理去除PCV2 VLPs中非VLPs蛋白的方法，具体步骤如下：

1）E.coli BL21(DE3)/pET28a-cap摇瓶表达；

2）制备PCV2 VLPs粗样品；

3）对大肠杆菌表达、制备的PCV2 VLPs样品进行热处理；