[发明专利]一种高效分泌表达抗VEGF-Fab抗体片段的高产菌株及其构建方法

说明书

本发明公开了一种高效分泌表达抗VEGF‑Fab抗体片段的高产菌株及其构建方法，其保藏编号为CCTCC M2017823，本发明通过RED重组无痕敲除的方法，删减了E.coliDH1基因组中11个非必需区，最终删减了总基因组的10.59%，确定了最优的Fab表达载体组合为pelB+HC+pelB+LC，通过无痕敲除方法在DH11基础上同时敲除prc和degp蛋白酶基因，与原始宿主DH11相比，有更高的分泌Fab的能力，最终提供了高产菌株DH11‑prc‑degp。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效分泌表达抗VEGF-Fab抗体片段的高产菌株及其构建方法。

背景技术

抗VEGF-Fab抗体片段是一种重组人源化单克隆抗体，目前，抗体Fab片段在癌症，病毒感染和炎症等疾病的诊断治疗中越发重要，占抗体市场份额逐渐上升。但是在降低表达成本，提高表达产量上一直存在着较大的困难。我们以E.coli作为表达菌株进行Fab的表达有明显的优势，不仅周期短成本低，可以高效地进行基因重组，引入突变，通过各种优化方法，能在短时间内提高Fab的表达量，溶解度和稳定性，而且与相应的scFv相比具有更高的抗体亲和力和稳定性。但是，Fab在E.coli中表达低是制约其大规模生产和应用的主要因素。目前，40％的E.coli基因组功能还未确定，只含有必要基因的最小基因组菌株有望成为代谢工程和计算机模拟的理想平台；而从另一方面，Fab抗体片段由于其结构的完整性以及功能多样性，是抗体成员中的一个研究重点，由于缺少Fc段，因此能够在E.coli中表达，但分泌始终是难点。Fab在E.coli中的分泌表达通常是分泌到周质腔中，进一步分泌到培养基中。在此过程中，Fab的表达序列以及宿主都会对其表达量产生很大的影响。

相较于无痕敲除来说，有痕敲除方法虽然相对比较简单，但通常会在基因组上留下抗性筛选标记，此标记会在基因组上永久存在。而菌株能够使用的抗性筛选标记是有限的，因此在同一个菌株中进行多次删除就受到了限制，且抗性标记整合到基因组上还会产生极性效应，影响上下游基因的表达，因此实现对E.coli的无痕删除就显得尤为重要了。

核酸归巢内切酶I-SceI被用作染色体双链断裂的诱导剂，对E.coli DH11的基因组分析发现，其中不含有I-SceI识别位点，避免了基因组被I-SceI酶切成碎片的风险，也为实现在同一菌株中进行连续敲除奠定基础。因此，I-SceI可以用来删除在基因组特定位点上的筛选标记。应用特异性的引物通过PCR的方法，就可以将删除了抗性基因的克隆挑选出来，从而获得菌株的无痕删除突变株。

我们基于基因删减的E.coli，从蛋白酶、基因组删减以及表达载体的角度对Fab的表达进行了优化。以此基因组功能更为确定的E.coli作为工程菌，优化表达抗VEGF抗体Fab片段。本发明通过建立E.coli DH11的无痕突变菌株，多次传代后，验证该DH11突变株的稳定性，最终成功获得了高产的无痕突变株。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效分泌表达抗VEGF-Fab抗体片段的高产菌株及其构建方法，通过无痕敲除技术，删减了E.coli DH1基因组中11个非必需区，最终删减了总基因组的10.59％。该删减菌我们命名为DH11；将DH11基因组上的蛋白酶基因prc和degp删除，最终总Fab分泌量由最初的17.1mg/L提高到46.6mg/L，成功构建了高产菌株DH11-prc-degp。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种高效分泌表达抗VEGF-Fab抗体片段的高产菌株，命名为DH11-prc-degp，已于2017年12月21日保藏于中国典型微生物保藏中心(武汉大学保藏中心)，其保藏编号为CCTCC M2017823。

本发明高产菌株的构建方法具体包括如下步骤：

(1)通过RED重组无痕敲除的方法，删减E.coli DH1基因组中非必需区，构建删减菌DH11；