[发明专利]三元穿梭载体及利用其构建CLBV侵染性克隆的方法

说明书

本发明公开了一种三元穿梭载体pCY，其核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示。还公开了一种构建CLBV侵染性克隆的方法：(1)提取感染CLBV植株总RNA，反转录后采用pCY‑CLBV1F、CLBV1R与CLBV2F、pCY‑CLBV2R分别进行PCR扩增，得到覆盖CLBV基因组全长的特异片段CLBV1、CLBV2；(2)用Stu I、Sma I酶切pCY；(3)TAR克隆：采用醋酸锂法将CLBV1、CLBV2和线性化pCY共转化酵母菌YPH501，通过同源重组获得CLBV全长cDNA克隆pCY‑CLBV；(4)pCY‑CLBV质粒转化农杆菌，接种柑桔或本生烟，鉴定获得CLBV侵染性克隆。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种三元穿梭载体及利用其构建CLBV侵染性克隆的方法。

背景技术

柑桔叶斑驳病毒(Citrus leaf blotch virus，CLBV)属乙型线形病毒科(Betaflexiviridae)柑桔病毒属(Citrivirus)的代表成员，可以通过嫁接侵染大多数的柑桔品种，还可以通过种子传播，具有一定的传播流行风险。构建CLBV侵染性克隆将有助于了解其分子特性及致病机理，对于CLBV的流行防控也具有重要作用。另外，CLBV在多数柑桔品种上不会引起明显的病毒感染症状，有望开发成为具有广泛应用前景的病毒载体。CLBV基因组大小约为8.7kb，包含三个开放阅读框(Open reading frame，ORF)，分别编码复制相关蛋白、运动蛋白及外壳蛋白，其中运动蛋白为沉默抑制子，5’-端有甲基化帽子结构，3’-端有poly A尾巴。

侵染性克隆不仅为病毒研究提供背景单一而可靠的遗传材料，还可用于研究病毒的移动、复制及其致病机理，同时还为深入研究病毒与寄主互作机制、进行病毒载体化改造和应用奠定坚实的基础。然而，病毒全长cDNA侵染性克隆的构建技术性较强，构建工作难度大。有研究表明，利用大肠杆菌构建较大基因组RNA病毒全长cDNA克隆时，由于其自身编码的病毒蛋白可能会对宿主菌产生毒性作用，从而导致非特异性重组，出现不稳定现象。这成为病毒侵染性克隆构建面临的最大困难和挑战。病毒全长基因组克隆在E.coli中存在的不稳定现象的机制仍不清楚。通常利用以下几个方法解决：将病毒序列分段克隆，侵染前再短暂的连接；或利用拷贝数目较低的载体；或是调控细菌生长的环境(如降低培养温度等)来减少毒性；也有利用插入内含子到病毒全基因组序列中来避免产生具有毒性的蛋白。但这些方法均耗时耗力且成功率低。

酵母转化伴随的同源重组(TAR)是一种利用酵母高效同源重组系统来实现多个相互存在同源序列的DNA片段组装方法。Youssef等(Youssef F,Marais A,Faure C,GentitP,Candresse T.Strategies to facilitate the development of uncloned or clonedinfectious full-length viral cDNAs:Apple chlorotic leaf spot virus as a casestudy.Virology Journal,2011,8(1):1-12)在构建苹果褪绿叶斑病毒(Apple chloroticleaf spot virus,ACLSV)时，从36个经限制性内切酶酶切正确的E.coli克隆中仅鉴定出1个有侵染性的克隆，表明ACLSV克隆在E.coli细胞存在着不稳定性，但经酵母TAR技术获重组克隆后，直接通过农杆菌介导接种获得了稳定的ACLSV的侵染性克隆。庹德财等(庹德财,沈文涛,言普,黎小瑛,周鹏.一种E.coli-Free的酵母同源重组系统稳定快速构建PLDMV侵染性克隆的新方法.热带作物学报,2017,38(8):1492-1500)在构建番木瓜畸形花叶病毒(Papaya leaf distortion mosaic virus,PLDMV)时，发现PLDMV在大肠杆菌中也存在不稳定现象，而当在PLDMV的P3基因中插入内含子时，经酵母重组后转化E.coli能获得测序正确的稳定的侵染性克隆。由于CLBV基因组较大，采用传统的酶切连接法构建其侵染性克隆，费时费力且成功率低。在前期的尝试中，利用大肠杆菌作宿主很难获得CLBV的侵染性克隆，猜测可能与前述不稳定性有关。