[发明专利]一种尿液exosome的蛋白标记物的检测方法

权利要求书

1.一种尿液exosome的蛋白标记物的检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)从新鲜收集的尿液中提取并纯化exosome，收集沉淀并重悬得到exosome悬液；

(2)分别用CD13和podocalyxin包被的磁珠对步骤(1)得到的exosome悬液进行分选，得到exosome分选液；

(3)将步骤(2)得到的分选液通过用BCA试剂盒测exosome的蛋白浓度；

(4)根据步骤(3)得到的蛋白浓度，将各分选液制备为蛋白上样标本，将所述标本进行CD13、Podocalyxcin和CD63 western blot检测后，鉴定得到所需的蛋白标记物。

2.如权利要求1所述的尿液exosome的蛋白标记物的检测方法，其特征在于，步骤(1)的详细步骤包括：

(i)往新鲜尿液中加入蛋白酶抑制剂混合物，在4℃、17000g下离心10分钟，收集上清；所述尿液、蛋白酶抑制剂混合物的体积比为50mL：4.22mL；

(ii)将步骤(i)中得到的上清在25℃、200000g下离心1小时，收集沉淀；

(iii)将步骤(ii)中得到的沉淀用蔗糖分离溶液重悬后得到初级重悬液，按200mg/mL的浓度在重悬液中加入二硫苏糖醇，在95℃下加热2分钟，在25℃、200000g下离心1小时，收集的沉淀用蔗糖分离溶液重悬后得到exosome悬液。

3.如权利要求2所述的尿液exosome的蛋白标记物的检测方法，其特征在于，在步骤(i)中，所述蛋白酶抑制剂混合物包括100mM NaN₃、10mM PMSF、1mM Leupeptin；

在步骤(iii)中，所述蔗糖分离溶液包括10mM Triethanolamine、250mM Sucrose。

4.如权利要求1所述的尿液exosome的蛋白标记物的检测方法，其特征在于，步骤(2)的详细步骤包括：

(i)将20μL涡旋处理后的免疫包被磁珠与200μL分选缓冲液混匀后置于磁场环境中1分钟，弃上清，加入步骤(1)得到的exosome悬液；

(ii)将exosome悬液在4℃下缓慢旋转孵育18～24小时，加入300μL分选缓冲液，轻拍混匀后置于磁场环境中1分钟，弃上清，加入400μL分选缓冲液，轻拍混匀后置于磁场环境中1分钟，加分选缓冲液重悬，得到exosome分选液。

5.如权利要求4所述的尿液exosome的蛋白标记物的检测方法，其特征在于，在步骤(i)、(ii)中，所述分选缓冲液为质量浓度为0.1％的BSA。

6.如权利要求1所述的尿液exosome的蛋白标记物的检测方法，其特征在于，步骤(3)的详细步骤包括：

(i)将步骤(2)得到的exosome分选液与RIPA裂解液按体积1:1混匀，冰上放置30分钟，得到样本；

(ii)用BCA试剂盒测exosome的蛋白浓度，即加入蛋白标准品、样本或ddH₂O各10μL孔，蛋白标准品浓度分别为1、0.8、0.6、0.4、0.2mg/mL，加入(A+B)混合液200μL/孔，56℃孵育30分钟，570nm读取OD值，通过标准曲线计算蛋白浓度。

7.如权利要求6所述的尿液exosome的蛋白标记物的检测方法，其特征在于，在步骤(i)中，所述RIPA裂解液包括：50mM、pH 7.4的PBS，质量浓度1％的NP40，质量浓度0.1％的SDS，100g/mL PMSF，质量浓度0.5％的脱氧胆酸钠，1mM钒酸钠，2μg/mL aprotinin，2μg/mLantipain，以及2μg/mL leupeptin；

在步骤(ii)中，所述(A+B)混合液中A、B的体积比为50：1。