[发明专利]一种对肝损伤具有修复作用的菲律宾蛤仔多肽的制备方法

说明书

一种对肝损伤具有修复作用的菲律宾蛤仔多肽的制备方法，该制备方法包括如下步骤：a）建立非酒精性脂肪肝病细胞模型；b）将菲律宾蛤仔去壳取内脏后放入蒸馏水中轻轻搅拌，洗去杂质后匀浆，备用；c）将步骤b）制得的文蛤匀浆液进行酶解，过滤后的滤液经过超滤膜，分别截取3个不同分子段酶解液，用G‑25葡聚糖凝胶层析，对所得的各个峰进行收集，获得菲律宾蛤仔多肽产物；d）将步骤c）获得的菲律宾蛤仔多肽产物分别作用于步骤a）的非酒精性脂肪肝病细胞模型细胞，以筛选使得非酒精性脂肪肝病细胞模型细胞TG含量减低率最大的酶解液进行收集，然后将收集的最大峰酶解液过Zorbax SB‑C18色谱柱，得到两个洗脱峰，收集大的洗脱峰高效液相检测其纯度显示为单一组分，即为对肝损伤具有修复作用的菲律宾蛤仔多肽产品。

技术领域

本发明涉及的是一种对肝损伤具有修复作用的菲律宾蛤仔多肽的制备方法，属于多肽制备技术领域。

背景技术

非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是以肝细胞脂肪变性和脂肪堆积为主要特征的病理综合征，目前治疗的方法主要采取减肥治疗、降脂治疗和血管紧张素转换酶抑制剂等保守治疗，但保守治疗目前尚缺乏特效方法，效果欠佳。近年来，我国的研究学者对从海洋动物中提取生物活性物质对肝损伤进行保护作用作了大量的研究。

菲律宾蛤仔是我们四大养殖贝类之一，从中提取的多肽具有抗氧化、抗肿瘤、增强免疫力等作用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种制备工艺简单，提取的胶原蛋白肽得率高，对NAFLD的修复作用明显，并可开发为功能食品的对肝损伤具有修复作用的菲律宾蛤仔多肽的制备方法

本发明的目的是通过如下技术方案来完成的，一种对肝损伤具有修复作用的菲律宾蛤仔多肽的制备方法，该制备方法包括如下步骤 ：

a）建立非酒精性脂肪肝病细胞模型，将正常肝细胞置于DMEM培养液、37℃、5％CO₂的培养箱中培养，待细胞贴壁达到80％后弃培养液，0.25％的胰蛋白酶消化，传代培养，选择生长状态良好的细胞，用软脂酸对正常肝细胞进行诱导，处理12h、24h、48h、72h后收集细胞并测定甘油三脂(TG)含量，选择使正常肝细胞TG含量明显增加且细胞生长良好的诱导时间，以建立体外非酒精性脂肪肝病细胞模型；

b）将菲律宾蛤仔去壳取内脏后放入蒸馏水中轻轻搅拌，洗去杂质后匀浆，存放于-20℃或-80℃备用；

c）将步骤b）制得的文蛤匀浆液进行酶解，灭酶后加入活性炭脱苦脱色，过滤出活性炭后的滤液经过超滤膜，分别截取5KDa分子量以下、5KDa～8KDa以及8KDa分子量以上的3个不同分子段酶解液，用G-25葡聚糖凝胶层析，对所得的各个峰进行收集，获得菲律宾蛤仔多肽产物；

d）将步骤c）获得的菲律宾蛤仔多肽产物分别作用于步骤a）的非酒精性脂肪肝病细胞模型细胞，以筛选使得非酒精性脂肪肝病细胞模型细胞TG含量减低率最大的酶解液进行收集，然后将收集的最大峰酶解液于280nm下过Zorbax SB-C18色谱柱，得到两个洗脱峰，收集大的洗脱峰高效液相检测其纯度显示为单一组分，即为对肝损伤具有修复作用的菲律宾蛤仔多肽产品。

作为优选：所述步骤a）中，所述的软脂酸为 15μg/mL，对正常肝细胞进行诱导；

所述步骤c）中，所述的酶解是：将文蛤匀浆液加入以文蛤匀浆液的质量计1%～2%的胃蛋白酶，酶解温度为30～40℃，酶解2～4h；然后调pH到6.5～7.5，以文蛤匀浆液的质量计，再次加入0.1%～0.2%的风味蛋白酶，酶解温度为40～55℃，酶解6～7h；

所述步骤d）中，使得非酒精性脂肪肝病细胞模型细胞TG含量减低率最大的为5KDa分子量以下分子段的酶解液，其TG含量降低率达54.2％；