[发明专利]短链脱氢酶突变体及其用途

说明书

本发明涉及生物技术领域，涉及短链脱氢酶突变体及其用途，该类突变体是多种短链脱氢酶的野生型出发经过突变得到的，具体涉及短链脱氢酶突变体和其制备方法以及利用短链脱氢酶突变体通过催苯乙酮衍生化合物的还原，制备有光学活性的苯乙醇衍生物的方法。

技术领域：

本发明涉及生物技术领域，涉及短链脱氢酶突变体及其用途，该类突变体是多种短链脱 氢酶的野生型出发经过突变得到的，具体涉及短链脱氢酶突变体和其制备方法以及利用短链 脱氢酶突变体通过催化苯乙酮衍生化合物的还原，制备有光学活性的苯乙醇衍生物的方法。

背景技术

手性醇是众多药用活性成分的一种万用合成砌块，传统的合成手性醇的方法有手性池 法、不对称合成法和拆分法等。上述三种方法都在商业化合成手性醇中有所应用，但它们却 有较多缺点：如使用大量昂贵的试剂、造成大量的污染、使用极端的操作条件等，这就需要 开发一种更经济的、环境友好的手性醇的合成方法。

在现在所有制备手性分子的技术中，生物催化是一种最有效且环境友好的方法(Nature 2012,485,185-194)，因为生物催化能够在温和的条件及环境温度下以极高的选择性执行复 杂的化学反应。正因如此，通过全细胞或者分离的酶生物催化合成手性醇便能够克服上述的 问题，其中利用酮还原酶(ketoreductases，缩写为KREDs)或者醇脱氢酶制备手性醇便是 可行方法之一(Chemical Reviews 2011,111,4088-4110.ChemicalReviews 2011,111, 4111-4140.)。

酮还原酶或羰基还原酶(EC 1.1.1.X)能够选择性的不对称还原酮得到相应的手性醇， 在还原过程中需要添加NADPH或者NADH作为辅因子。酮还原酶的底物为前手性的酮，类型比较广泛，如α酮酯、β酮酯、脂肪链酮、环状酮等。在手性药物及其中间体的合成过 程中，酮还原酶正在得到广泛的应用，以调脂的他汀类药物为例，其关键中间体3，5-二羟 基酸的侧链的合成需要非常苛刻的条件，而酮还原酶为其立体选择性合成提供了多种更绿色的改进路线(Angewandte Chemie International Edition 2005,44,362-365.)。日本的Daicel和 Kaneka公司分别建立了利用醇脱氢酶或羰基还原酶，同时利用葡萄糖或甲酸脱氢酶来循环 酶的辅因子的合成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的生物还原系统。Kaneka公司利用重组的工程 菌，可将300g/L的底物转化为产物，转化率可达96％，100％ee。Codexis公司利用醇脱氢 酶/葡萄糖脱氢酶的生物还原系统建立了相似的路线，同时通过利用脱卤素酶将氯原子替换 为氰基来合成(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯(HN)。此过程由Lonza公司工业化生产，并提供 给辉瑞公司用于合成阿托伐他汀钙，此过程获得了2006年的由美国环保署设立的美国总统 绿色化学挑战奖。BMS公司利用类似的酮还原酶，能够将6-苯甲氧基-3,5-二酮基己酸甲酯 双还原直接产生有两个手性中心的(3R,5S)-二醇的手性中间体。因此能够将前体酮还原成手 性醇的酮还原酶具有很大的应用前景；

而目前制约酮还原酶应用的主要问题就是天然的酮还原酶存在一定的缺陷，如活性低、 选择性差、选择性与期望相反等，使其在生产实践中的应用受到一定限制，成功修饰和改造 酮还原酶使其具有更加良好的性质是一个研究的热点。例如Codexis公司通过大量的突变及 筛选，得到了能够用于制备阿托伐他汀(Green Chemistry 2010,12,81-86.)、孟鲁斯特(Organic Process ResearchDevelopment 2009,14(1),193-198.)、克唑替尼(Nature 2012,485, 185-194)等手性药物关键中间体的酮还原酶突变体。