[发明专利]一种快速筛查食源性病原菌的方法

说明书

本发明公开了一种快速筛查食源性病原菌的方法，属于食品安全检测技术领域。所述食源性病原菌快速筛查方法基于细菌特异性酶反应，反应体系包括支持目标菌生长的营养成分、干扰菌抑制剂及细菌特异性酶试卤灵类反应底物，测试时通过将定量测试样品放入反应体系中，在适宜温度下培养5~8h，直接观察反应体系中的颜色变化或在573nm波长激发后，检测585nm处荧光的产生与否即可获得食源性病原菌定性检测结果。本发明的食源性病原菌快速筛查方法，使用方式与常规操作相同，但无需前增菌和选择性增菌，一步直接培养即可获得检测结果，具有简便、快速、高效性的优点。本发明的快速筛查食源性病原菌方法适用于食品生产加工企业、食品卫生监控基层单位对食源性病原菌的快速筛查和监测，应用前景广泛。

技术领域

本发明涉及一种微生物检测方法，尤其涉及一种食源性病原菌检测。

背景技术

食源性疾病是全球最普遍的公共卫生问题，其中，食品中污染的病原细菌是引起食源性疾病的主要因素之一，因此，无论食品生产加工企业、食品卫生监管部门对食源性病原菌的常规监控或当食物中毒暴发时，快速识别食源性病原菌显得至关重要。常见食源性致病菌包括沙门氏菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、志贺氏菌等，是目前我国保证大宗食品安全的必检项目。

食源性病原菌的传统检测方法是培养法，但操作繁琐，费时耗力，难以满足当今食品快速流通的检测需要，随着科学技术的发展和和进步以及人们食品安全意识的增强，对微生物快速检测技术的研究日渐深入，如基于遗传特征分析的实时荧光PCR、LAMP、基因芯片等分子生物学方法、基于表型特征分析的全自动微生物鉴定仪、生物质谱等方法，这些方法不仅需要购置设备、配备专业技术人员，现代检测方法的检测限一般在10²~10⁴cfu/ml范围，由于食品经过加工、深加工、冷冻、包装、储藏等过程，食品中的致病菌会受到损伤，活力下降，为了防止带有致病菌食品的漏检，在检测前通常需要前增菌、甚至选择性增菌、选择性分离，获得纯菌落后才能上机实验，过程复杂繁琐，检测周期较长。

应用细菌酶特异性分离和检测病原菌的原理已开发出多种产品，如利用吲哚类底物检测大肠菌群或金黄色葡萄球菌的培养基等，包括ZL201310603799.9一种金黄色葡萄球菌特异性显色培养基、ZL 201410101820.X用于分离和检测阴沟肠杆菌的显色培养基、ZL201110275619.X一种大肠菌群的显色培养基及其快速检测卡等。这些培养基中添加了人工合成的糖苷类底物，该类底物的发色基团为不溶于水的吲哚类物质，其附着于菌落表面，被空气中的氧自然氧化产生颜色，通常观察固体平板上菌落生长的颜色变化来判断结果；也有使用产荧光的伞形酮类物质，可溶于水但培养基pH值变化影响其荧光强度，结果不稳定，且需要在365nm波长下观察荧光，目前仅限于大肠埃希氏菌的测定，还有酚类发色底物，在溶液中极易分解，只能现用现配，还有喹啉类发色基团等，需要借助其他物质发生化学反应才能产生颜色变化，总之，现阶段的产品均不适用于液体培养基，主要用于样品前增菌和选择性增菌之后对目标菌的分离，如食品安全国家标准GB4789.38-2012 大肠埃希氏菌计数，伞形酮类物质仅用于增菌后对目标菌的分离计数。

本发明所述的快速筛选食源性病原菌的方法主要应用试卤灵类底物。试卤灵属氧杂蒽类荧光染料，对其7-位酚羟基的取代作用会导致荧光淬灭、颜色变浅呈淡黄色，当取代基与相关物质作用而移除后，又重新释放出试卤灵，使溶液呈亮粉色并显示强的红色荧光，最大吸收波长为573nm左右，最大发射波长位于585nm处。当pH值从4至7时，荧光逐渐增强，当pH值＞7时，试卤灵主要以阴离子形式存在，而且光谱性质几乎不再随pH而改变。因为其分析波长长、受样品背景干扰少、水溶性好还具有良好的细胞膜通透性和分散性，目前主要应用于生物酶活性的测定，但尚未见用于病原菌的识别或检测。