[发明专利]用于构建中棉所50指纹图谱的SSR引物及其应用

说明书

本发明公开了用于构建中棉所50指纹图谱的SSR引物及其应用，属于中棉所50的分子生物学鉴定领域。本发明根据GenBank dbEST数据库及专业棉花数据库CMD上释放获得的棉花EST序列数据设计并初步筛选获得268对SSR引物。本发明在上述268对引物中筛选获得106对具有差异效果的引物。本发明进一步对上述106对引物进行筛选，选出差异较为稳定、多态性好的15对核心引物，加上一对Bt基因特异引物，用于构建中棉所50的特异指纹图谱。本发明还公开了所述SSR引物在构建中棉所50指纹图谱以及鉴定中棉所50中的应用。本发明所述SSR引物及所构建的指纹图谱对中棉所50的品种鉴定与推广等具有重要价值。

技术领域

本发明涉及用于构建中棉所50指纹图谱的SSR引物，还涉及所述SSR引物在中棉所50鉴定以及构建中棉所50指纹图谱中的应用，属于中棉所50的分子生物学鉴定领域。

背景技术

中棉所50是由中国农科院棉花所早熟课题组育种专家所培育的，2007年通过国家审定，在早熟品种中推广面积较大。棉花国家区试自2012年始，重新开启棉花早熟组试验，中棉所50作为对照品种入选，至今已有5年。但在试验及推广过程中，经常发现有数量不等的杂株存在。这一方面干扰了国家早熟区域试验的正常进行，一方面也可能给广大棉农带来经济上的损失。以往鉴定中棉所50的纯度，主要以田间鉴定为主，费时费工。DNA分子标记的出现和快速发展，为中棉所50的准确鉴定提供了一种新的技术手段。简单重复序列(Simple sequence repeat，SSR)分子标记具有数量丰富、共显性遗传、信息含量高、分析方法简单、结果重现性好等优点，使其成为构建品种分子身份证的较理想的分子标记技术，并且已成功应用于大豆、玉米、小麦、水稻、棉花等作物中。

在被子植物中，卵子和精子核融合形成二倍体的合子，最终发育成胚；受精事件诱发母体的二倍体珠心细胞分化成种皮。因此，棉籽种皮是全部继承母本遗传信息的组织，通过分离种皮并从中提取DNA、构建指纹图谱，能够获得母本的指纹；棉籽种仁基本成分则是由卵子和精子核融合形成的二倍体种胚。结合二倍体种胚和母本指纹，就可分析推算该棉花品种是常规种，还是杂交种。早期已有花生、玉米等种皮DNA提取方法的报道(赵久然,刘龙洲,王凤格等.利用杂交玉米F1代种子果皮组织鉴定母本真实性的SSR研究[J].玉米科学，2004，12(3):6-8；刘龙洲.自玉米F1种子获得父本、母本全套DNA指纹图谱的研究[D].新疆农业大学，2004；石运庆,苗华荣,陈高等.花生种皮及籽仁DNA提取方法的研究[J].花生学报，2008,37(4)：37-39.)。棉花的相关报道目前还较少见。为了快速鉴定中棉所50，特采用目前常用的SSR检测技术，对中棉所50同时进行种皮DNA及种胚DNA的双重鉴定，构建指纹图谱，以确保中棉所50的品种纯度。但这种方法存在成本偏高、耗时、且一次检测位点较为有限等不足。因此，开发一种利用专用引物组快速鉴定棉花品种中棉所50的方法，具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供用于构建中棉所50指纹图谱的SSR引物；

本发明所要解决的第二个技术问题是提供所述的SSR引物在中棉所50鉴定以及构建中棉所50指纹图谱中的应用。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明根据GenBank dbEST数据库及专业棉花数据库CMD(cotton markerdatabase)上释放获得的棉花EST序列数据进行了陆地棉SSR引物的设计，并根据设计引物的稳定性、渗透性、产物的大小以及前后引物的Tm值差异进行了初步筛选，获得268对引物。本发明利用中棉所6个杂交种的6对亲本，对所设计的268对引物的退火温度及扩增效果进行了初步筛选，结果在268对引物中有248对引物扩增出明确条带，其中106对为具有差异效果的引物(表现形式主要以条带长度不一致)，在总引物中占据了40％的比例，证明本发明所述SSR引物具有一定的多态性。