[发明专利]一种内源L-门冬酰胺酶II基因敲除的宿主菌、其制备方法及其应用

说明书

本发明涉及一种内源L‑门冬酰胺酶II基因敲除的宿主菌、其制备方法及其应用。具体而言，本发明涉及一种敲除大肠杆菌内源L‑门冬酰胺酶II基因的方法，并获得敲除该基因的宿主菌株。利用打靶载体敲除的方式，所述宿主菌基因组不含有编码L‑门冬酰胺酶II及其变体的基因。采用本发明提供的宿主菌，可以重组表达欧文氏菌、埃希氏菌等不同微生物来源的L‑门冬酰胺酶II及其变体。

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种敲除内源性L-门冬酰胺酶II基因的大肠杆菌宿主菌株的制备方法及该宿主菌株的应用。

背景技术

L-门冬酰胺酶II是一种能催化门冬酰胺水解生成门冬氨酸和氨的脱氨酶。该酶能去除细胞外的L-门冬酰胺，从而阻止依赖于L-门冬酰胺进行蛋白质合成的癌细胞的生长。在临床上，L-门冬酰胺酶II主要用于治疗急性淋巴细胞白血病和淋巴瘤。

目前市场上的L-门冬酰胺酶II制剂来源于两种微生物，即大肠埃希氏菌(Escherichia coli)和欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)，L-门冬酰胺酶II为相同亚单位的四聚体，分子量为141kDa，单体无酶活性。这两种来源的L-门冬酰胺酶II较少出现交叉过敏反应，根据欧盟肿瘤研究所的临床研究，两种酶的疗效接近，但29％的白血病患者对大肠埃希氏菌来源的L-门冬酰胺酶II有严重过敏反应，必须用菊欧文氏菌来源的L-门冬酰胺酶II治疗才能取得满意疗效。因此，欧文氏菌来源的L-门冬酰胺酶II可以作为多药化疗方案的组分，适用于治疗对埃希氏菌来源的L-门冬酰胺酶II有超敏反应的急性淋巴细胞白血病患者。

专利CN101083118B从大肠埃希氏菌中提取天然的L-门冬酰胺酶II，发酵液产量为10单位/mL。专利CN 101831417A与专利CN 1397645A提供了一种从欧文氏菌体中提取天然L-门冬酰胺酶II的方法，发酵液产量为50-80单位/mL。从上述两种菌种获得天然目的蛋白，产量低，经济效益差。

通过基因工程技术，可以工业化大规模重组表达L-门冬酰胺酶II。Mojtaba等人(2011 Biharean Biologist.5(2):96-101)利用BL21(DE3)重组表达大肠埃希氏菌的L-门冬酰胺酶II，产量可达到130单位/mL，吴敬等人(2000中国药学杂志.35(4):268-272.)重组表达大肠埃希氏菌AS1.357的L-门冬酰胺酶II，产量可达到214单位/mL。但是大肠杆菌能够本底表达L-门冬酰胺酶II，所获得的L-门冬酰胺酶II产品混有大肠杆菌本底表达的L-门冬酰胺酶II，导致产品纯度的不均一，有潜在的免疫原性安全风险。另外杂质也可能导致人体对药物形成免疫，导致治疗失败。

专利CN 101484181A为了解决这个问题，在BL21(DE3)宿主菌中，使用游离的重组表达载体生产BL21来源的L-门冬酰胺酶II，从而获得均一纯度的L-门冬酰胺酶II，但是，这种策略也存在ansB基因及宿主菌基因组不稳定性的风险。2000年Kirill A.等人(2000PANS.97(12):6640-6645.)发现，利用与宿主菌目标基因的同源序列片段或质粒，通过同源重组的方式使目标基因被替换或者插入大肠杆菌基因组，从而使大肠杆菌目标基因失去活性。但游离的重组表达载体中含有的ansB基因(L-门冬酰胺酶II基因)与大肠杆菌基因组上的ansB基因高度同源，极有可能发生同源重组，导致宿主菌基因组结构改变及基因活性丧失，不能持续稳定表达L-门冬酰胺酶II。

为了解决上述ansB基因及宿主菌基因组不稳定性的风险，我们通过基因敲除技术，将大肠杆菌自身的L-门冬酰胺酶II基因(ansB)进行敲除，使之不能表达自身的L-门冬酰胺酶II。但是，并非所有细菌的任何基因都能够成功的进行基因敲除，对细菌的基因敲除技术难点在于影响重组效率的因素很多，例如细菌种属、亚型，被敲除的基因，感受态细胞状态，操作方法等不同，重组效率差异很大(张雪等,2008中国生物工程杂志.28(12):89-93.)。另外，打靶载体的打靶序列选择不当，也会导致重组效率很低而敲除失败，合适的打靶序列及打靶载体至关重要。