[发明专利]一种杏香兔耳风组培技术繁育方法

说明书

本发明公开了一种杏香兔耳风组培技术繁育方法，包括外植体的选择、外植体的清洁与消毒、丛生芽诱导、丛生芽增殖及生根等步骤。本发明对杏香兔耳风的组织培养技术展开了探索，确立了无菌材料的获得、愈伤组织的诱导、愈伤的分化成芽、生根等理想培养条件，最终成功建立了杏香兔耳风组培苗的无性繁殖体系，为实现对杏香兔耳风野生资源的保护、栽培、对种苗的需求以及基因库的建立奠定了技术基础，解决野生珠子参产量低、供应少和自然栽培周期长的问题。

技术领域

本发明涉及一种中药材的组织培养方法，属于植物组织培养及中药材种植领域，特别涉及杏香兔耳风的组织培养方法。

背景技术

杏香兔耳风Ainsliaea fragrans Champ 为菊科兔耳风属植物，以全草入药，具有清热解毒，利湿，止血的功效，主要用于治肺痈，乳腺炎，疳积，骨髓炎，毒蛇咬伤。杏香兔耳风主要分布于台湾、福建、浙江、安徽、江苏、江西、湖北、四川、湖南、广东、广西、云南等省，生于海拔30~850米的山坡灌木林下或路旁、沟边草丛中，云南在海拔2000米附近亦有分布。目前以本植物作为药材的来源全部为野生资源，整株采集，野生资源繁殖方式以种子繁殖为主，种子成熟时间一般为12月~次年1月，而药材采收时间一般为生殖生长前期（8~10月），致使野生资源的后代繁殖遭到切割，从而导致野生资源蕴藏量逐年降低。近年来有部分企事业单位开展了杏香兔耳风种植技术的研究，但限于种子采种与药材采收的时间矛盾，杏香兔耳风的种植处于发展初期阶段，尚未 形成规模。同时，杏香兔耳风虽分布较广，但各地区所产药材中有效成分含量存在较大区别，不同批次甚至同一批次药材存在质量差异较大情况，究其原因在于杏香兔耳风品种较杂，需要选育特定高质品种用于药材生产。

发明内容

本发明针对以上所述的传统繁殖方法的不足，发明了一种组分简单、操作简便、生产周期短、可为规模化种植短期内快速提供高质品种的优质种苗的组培技术繁育方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

1．外植体的选择：将健壮植株，栽植于实验室内，每隔3天用75%多菌灵500倍液，于早上十点左右喷施5次以上，选取无病斑幼嫩叶及幼嫩茎段；

2．外植体的清洁：将选取的外植体剪成约2~3cm大小，用饱和肥皂水溶液涮洗10~15min，然后用自来水冲洗3-4次至无肥皂液残留，然后加适量水，再加2~3滴吐温-80，振摇10~15min，用自来水冲淋50~60min。

3．外植体的消毒：将清洗好的外植体倒出全部水分，转移至超净工作台内，加入75%酒精振摇20~25s，无菌水涮洗3~4次，在加入饱和漂白粉溶液振摇15~20min，无菌水涮洗3~4次，最后加入0.1%升汞溶液+1滴吐温-80振摇7~8min，无菌水涮洗5~6次，污染率为40~50%。

4．丛生芽诱导培养：将消毒好的外植体剪取边缘伤口，接种于WPM+1.0~2.0mg/L2，4-D+0.1-0.2mg/L NAA+ 0.5~1.0mg/L TDZ的培养基中，在温度23-27℃，光照强度1000-2000lux，单日光照时间为8h的环境条件下培养，约培养15天左右开始出愈，再培养25天左右开始长丛生芽，诱导率为50~60%;

5．丛生芽的增殖培养：杏香兔耳风经诱导产生丛生芽后，将其愈伤带丛生芽切成约0.5m2的小块，接种于MS+0.05~0.20mg/L NAA+1.0~2.0mg/LBA +5.0-7.0mg/L KT的增殖培养基中，在温度23-27℃，光照强度3000-4000lux，单日光照时间为12h的条件下培养，培养约30天后可获得大量较大丛生芽，增殖系数为6~7；

6．丛生芽的生根培养：将增殖后的丛生芽切成单芽，接种于WPM+2.0~3.0mg/L NAA+0~2.0mg/LIBA+1.0g/L C*的生根培养基中，在温度23-27℃，光照强度3000-4000lux，单日光照时间为12h的环境下培养，培养约30天后，可产生2~3条2~3cm的粗壮根，生根率为95%以上。