[发明专利]一种抗猪流行性腹泻病毒S1蛋白杂交瘤细胞株的制备方法

说明书

本发明涉及一种抗猪流行性腹泻病毒S1蛋白杂交瘤细胞株的制备方法，该由方法由以下步骤组成：(1)哺乳细胞表达的重组猪流行性腹泻病毒S1蛋白与206佐剂1：1充分混合后注射BALB/c小鼠，5μg/只。分别在首免后14d和35d进行两次加强免疫，采用206佐剂，剂量仍为5μg/只；(2)ELISA方法测定血清抗体滴度高于1：10⁵的小鼠采集脾B淋巴细胞与杂交瘤细胞进行融合，挑选阳性克隆后进行亚克隆得到所述的抗猪流行性腹泻病毒S1蛋白杂交瘤细胞株。本方法所制备的杂交瘤细胞株可表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白的单克隆抗体，该单克隆抗体可用于检测猪流行性腹泻病毒。

技术领域

本发明属于细胞工程与免疫学领域，具体涉及表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

背景技术

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea)由猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemic diarrhea virus)引起，临床上以猪的急性肠炎、呕吐、水样腹泻、脱水以及哺乳仔猪的高死亡率为特征1978年本病首次发生于比利时和英国。1984年，宣华等通过荧光抗体试验和血清中和试验证实该病在我国的存在。目前世界上许多主要养猪国家都有该病的报道，尤其以欧洲和亚洲最为严重。

S蛋白是位于病毒粒子表面的纤突糖蛋白，属于1型跨膜糖蛋白，由4部分组成，分别是信号肽区(1-18aa)、4个中和表位(499-638aa、748-755aa、764-771aa和1368-1374aa)、1个跨膜接构域(1 334-1 356aa)以及1个短的胞浆区。通过比较与其他冠状病毒S蛋白的同源性，也可将PEDV S蛋白分为S1(1-789aa)和S2(790-1383aa)两个接构域。S蛋白以三聚体的形式存在于病毒囊膜表面，参与病毒与宿主细胞的吸附和融合，同时它也是诱导宿主产生中和抗体的主要抗原分子。另外，S蛋白与病毒的细胞适应性和病毒毒力有关。因此，S蛋白是开发PEDV疫苗的重要靶点。

目前猪流行性腹泻病毒血清学检测方法研究进展较慢，主要原因在于该病毒的实验室培养较为困难，且原核表达的蛋白由于不具备翻译后修饰过程，因此原核表达的重组蛋白制备的单克隆抗体检测天然蛋白时出现假阴性几率较高，因此很难在临床上进行推广。本发明在获得哺乳细胞表达的猪流行性腹泻病毒S1蛋白的基础上，免疫小鼠制备单克隆抗体，为猪流行性腹泻病毒血清学检测方法的建立奠定基础。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种抗猪流行性腹泻病毒S1蛋白杂交瘤细胞株的制备方法，该方法所制备的杂交瘤细胞株可表达用于检测猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体。

本发明所解决的技术问题采用的技术方案是：

一种抗猪流行性腹泻病毒S1蛋白杂交瘤细胞株的制备方法，该由方法由以下步骤组成：

(1)哺乳细胞表达的重组猪流行性腹泻病毒S1蛋白与206佐剂1：1充分混合后注射BALB/c小鼠，5μg/只。分别在首免后14d和35d进行两次加强免疫，采用206佐剂，剂量仍为5μg/只；

(2)ELISA方法测定血清抗体滴度高于1：10⁵的小鼠采集脾B淋巴细胞与杂交瘤细胞进行融合，挑选阳性克隆后进行亚克隆得到所述的抗猪流行性腹泻病毒S1蛋白杂交瘤细胞株。

本发明还提供一种表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白的单克隆抗体，该单克隆抗体由上述方法得到的抗猪流行性腹泻病毒S1蛋白杂交瘤细胞株表达。其中，所述单克隆抗体为IgG 2b的亚型，轻链为κ链。

本发明还提供一种检测猪流行性腹泻病毒的间接免疫荧光试剂盒，该间接免疫荧光试剂盒含有上述单克隆抗体。