[发明专利]CRISPR-Cas9靶向敲除人肠癌细胞CNR1基因及其特异性的sgRNA

说明书

本发明公开了CRISPR/Cas9靶向敲除人肠癌细胞CNR1基因及其特异性sgRNA序列。首先是获得特异性靶向CNR1基因第二外显子的sgRNA，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示；其次是构建CNR1基因的sgRNA到慢病毒载体系统，该系统含有Cas9蛋白；最后将含有该sgRNA的CRISPR/Cas9慢病毒感染人肠癌HT‑29细胞，获得CNR1蛋白表达水平显著降低的细胞株。本发明具有操作步骤简单、sgRNA靶向性好、且对CNR1基因切割效率高；此外，所构建的CRISPR/Cas9慢病毒系统具有敲除效率高的优势，并能特异性敲除CNR1基因，得到敲除CNR1基因的人肠癌细胞，从而为进一步研究肠癌细胞中CNR1的作用机制提供强有力的工具。

技术领域

本发明属于基因工程领域，更具体地说涉及CRISPR/Cas9靶向敲除人肠癌细胞CNR1基因及其特异性的gRNA。

背景技术

内源性大麻素系统(Endocannabmd，EC)是近年来研究较为深入的一个脂质信号和神经调节系统，广泛参与了体内一些生理或病理过程的调节。主要由内源性大麻素、大麻素受体、内源性大麻素的合成酶及降解酶等组成。近年已发现有两种大麻素受体，CNR1受体和CNR2受体，二者均属G蛋白偶联受体。已有大量的研究表明，CNR1是介导内源性大麻素发挥作用的关键因子。CNR1受体包含473个氨基酸，主要位于脑、脊髓与外周神经系统中，脑中的CNR1受体主要分布于基底神经节(黑质、苍白球、外侧纹状体)、海马CA锥体细胞层、小脑和大脑皮质中。推测CNR1受体的这种分布可能与大麻类物质对认知、记忆、运动控制的调节有关；下丘脑的CNR1受体表达区域与食欲调节密切相关。CNR1受体也在外周组织表达，如眼、胃肠道、胎盘和前列腺等；其在胃肠道的分布可能与胃肠蠕动和食管下括约肌功能调节相关，并成为在外周组织发挥作用的基础。CNR1可以激活多重细胞内信号传导通路，调节能量的动态平衡，与肥胖症和糖尿病发生密切相关。

肠癌是指发生于肠道的癌病类疾病，是胃肠道中常见的恶性肿瘤，发病率仅次于胃癌和食管癌。目前，研究人员在肠癌的发生机制方面做了大量研究，发现了众多参与肠癌进展的途径和机制，如原癌基因激活、抑癌基因失活(点突变、重排、缺失)及染色体异常等，但目前肠癌发生与进展中所涉及的分子机制仍有许多尚未明确，需要进一步研究。

CRISPR/Cas系统是最近几年兴起用于靶向基因特定DNA修饰的重要工具，具有快速、高效及特异性靶向等优势，已被应用于多种模式生物，包括人、小鼠、大鼠、斑马鱼、秀丽隐杆线虫、植物及细菌。CRISPR RNA(crRNA)与转录激活crRNA退火形成的复合物能特异识别基因组序列，引导Cas9核酸内切酶在目的片段生成DNA双链断裂。这个识别复合体可以通过融合crRNA与tracrRNA序列形成sgRNA进行简化。基因组的靶序列中有长约20bp的片段与crRNA或sgRNA互补配对；靶序列末端的三核苷酸区域PAM(5’-NGG-3’)为spCas9识别位点，是实现剪切功能的关键。sgRNA能否做到特异性、精确靶向目标基因是CRISPR/Cas9特异性敲除目标基因的先决条件，脱靶和错误靶向都会影响CRISPR/Cas9对目标基因的特异性敲除，因此，能够设计、制备出精确性和特异性靶向目标基因的sgRNA成为CRISPR/Cas9基因敲除的关键技术。

本发明利用CRISPR/Cas9慢病毒系统，获得敲除CNR1基因的人肠癌细胞，为研究肠癌细胞中CNR1的作用机制提供有力工具。

参考文献：

1)Bensaid M,Gary-Bobo M,Esclangon A,Maffrand J P,Le Fur G,Oury-Donat Fand Soubrie P,2003.The cannabinoid CB1receptor antagonist SR141716increasesAcrp30mRNA expression in adipose tissue of obese fa/fa rats and in culturedadipocyte cells.Molecular Pharmacology,63(4):908～914