[发明专利]用于结直肠癌相关基因甲基化的检测方法、试剂盒及应用

说明书

本发明提供了用于结直肠癌相关基因甲基化的检测方法、试剂盒及应用。本发明涉及了用于检测LAD1基因甲基化的特异性引物对和探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～4所示。本发明还提供了所述的特异性引物对和/或探针的应用、检测LAD1基因甲基化试剂盒和LAD1基因甲基化检测方法。本发明的检测方法具有高通量特性和高敏感性，且无需在PCR后进行电泳和分子杂交等操作，可减少实验过程中污染和操作误差，还能节约时间和节省试剂消耗，不仅能减少检测成本，提高检测效率，将为结直肠癌早期诊断和无创快速筛查提供有效手段，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于生物检测领域，特别涉及用于结直肠癌相关基因甲基化的检测方法、试剂盒及应用。

背景技术

由于现有的结直肠癌筛查方法，如结肠镜检查、粪便sDNA检查、血清癌胚抗原(CEA)水平检查，存在效率低、准确性低或侵入性的特点，导致结直肠癌患者不能及时得到诊断，多数结直肠癌患者被发现时已经处于发展晚期，治疗和预后效果不佳。因此，寻找一种简单、安全、特异性高、灵敏性高的早期筛查方法是当前结直肠癌预防和治疗的关键。

DNA甲基化(DNA methylation)作为重要的表观遗传修饰之一，它与肿瘤的发生发展关系密切。狭义的DNA甲基化指由DNA甲基转移酶(DNA methyhransferase，DNMT)介导，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将一个甲基基团共价结合到胞嘧啶(Cytoine，Cyt)环5位碳上，成为5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5-mC)的化学修饰过程。DNA甲基化通常发生于CpG二核苷酸中，对基因的表达和调控有重要作用。目前，DNA甲基化已应用于肿瘤机制和诊治研究。结直肠癌的DNA甲基化研究中主要采用的是肿瘤组织，但是由于获取难度大，肿瘤组织样品并不适用于广泛筛查和早期诊断。研究者们尝试从非侵入性生物样品(如血液)中寻找生物标志物。此类样品具有适合大量样本收集、操作及处理简便等优点，其DNA甲基化有望成为非侵袭性肿瘤标志物来源，以更好地运用于临床。

由于一些抑癌基因异常甲基化常发生在肿瘤形成的开始，可运用于早期检测。而混杂因素可能导致检测的假阳性，早期检测最关键的问题是区分非肿瘤如年龄、饮食等相关的甲基化与肿瘤特异甲基化，设计研究方案时应考虑各种混杂因素或选用独立个体。尽管目前已有一些抑癌基因如SPG20、FBN1、VIM等甲基化检测用于结直肠癌的早期诊断，但往往会出现特异性或灵敏性不强的特点。

目前常用来进行检测基因甲基化的方法有甲基化特异性PCR(MS-PCR)、亚硫酸氢盐处理和测序等方法。MS-PCR方法经济实用，无需特殊仪器，因此是目前应用最为广泛的方法。在亚硫酸氢盐处理后，即可开展MS-PCR。在传统的MSP方法中，通常设计两对引物，一对MSP引物扩增经亚硫酸氢盐处理后的DNA模板，而另一对扩增未甲基化片段。若第一对引物能扩增出片段，则说明该检测位点存在甲基化，若第二对引物能扩增出片段，则说明该检测位点不存在甲基化。这种方法灵敏度高，可用于石蜡包埋样本，且不受内切酶的限制。不过也存在一定的缺陷，需要预先知道待测片段的DNA序列，并设计出好的引物，这至关重要。另外，若存在亚硫酸氢盐处理不完全的情况，那可能导致假阳性。亚硫酸氢盐处理和测序一度被认为是DNA甲基化分析的金标准。它的过程如下：经过亚硫酸氢盐处理后，用PCR扩增目的片段，并对PCR产物进行测序，将序列与未经处理的序列进行比较，判断CpG位点是否发生甲基化。这种方法可靠，且精确度高，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序，过程较为繁琐、昂贵。

因此，甲基化检测特异性或灵敏性不强等技术问题还有待解决。

发明内容

本发明的第一目的在于克服现有技术的缺点与不足，为改善甲基化检测特异性或灵敏性不强等问题，提供用于检测LAD1基因甲基化的特异性引物对和探针。

本发明的第二目的在于提供所述的特异性引物对和探针的应用。

本发明的第三目的在于提供用于检测LAD1基因甲基化的试剂盒。