[发明专利]肝癌的双靶点CAR-T治疗载体及其构建方法和应用

说明书

本发明涉及提供了肝癌的双靶点CAR‑T治疗载体及其构建方法和应用。双靶点CAR‑T治疗载体由慢病毒表达载体pCDH‑EF1α‑MCS‑(PGK‑Puro)和CAR结构两部分构成。所述的CAR结构具体为Igkappa‑iRGD‑CD133scFv–(G₄S)₅‑GPC3V_H‑(G₄S)₃‑GPC3V_LscFv‑CD8α‑CD28‑CD137‑CD3ζ‑T2A‑CCL19。以病毒感染方式获得含有该治疗载体的T细胞，即CAR‑T细胞(Chimeric Antigen Receptor T‑Cell)，通过表达CAR结构，可靶向识别和杀伤肝癌细胞。

技术领域

本发明涉及一种CAR-T治疗载体，尤其是涉及肝癌的双靶点CAR-T治疗载体及其构建方法和应用。

背景技术

肝癌是常见的恶性肿瘤之一，目前临床主要采取手术为主、介入、局部放疗和化疗为辅的综合治疗方法，但存在复发率高，生存时间短的问题，且多数病人就诊时已发展至进展期或存在远隔器官转移而无法进行上述治疗。近年来，免疫生物疗法被认为是最有希望的非手术治疗策略。

LAK细胞、DC、CIK细胞都曾作为肿瘤的免疫治疗手段，但是以上各种治疗方法均缺乏特异性识别肿瘤相关抗原(tumor associated antigen，TAA)和杀伤特定肿瘤靶细胞的能力；而肿瘤免疫编辑的过程又会使靶细胞表面的主要组织相容性复合物(mainhistocompatibility complex，MHC)在肿瘤细胞表面表达下降，形成免疫逃逸，使肿瘤细胞可成功躲避T细胞攻击。

CAR-T细胞疗法是通过基因工程技术在T细胞表面人为过表达能识别特定的肿瘤表面抗原的单链抗体可变区基因片段，从而使T细胞识别特定抗原、杀伤表达该抗原的靶细胞。同时，由于CAR-T细胞是采用抗体识别抗原模式，因此不受主要组织相容性复合物(mainhistocompatibility complex，MHC)的限制。近年来，CAR-T细胞在血液肿瘤治疗中取得了令人振奋的效果，如对晚期复发难治性急性淋巴细胞白血病(ALL)治疗的完全缓解(CR)可达到90％，对慢性淋巴细胞白血病(CLL)和部分B细胞淋巴瘤的CR达到50％以上。在治疗实体瘤方面，其安全性和有效性已得到证实。

中国专利CN107557388A公布了用于CAR-T细胞制备的慢病毒载体及其构建方法和在制备抗肿瘤细胞制品中的应用，同时还建立了荧光定量PCR检测病毒滴度的方法，为临床应用提供了检测标准。

中国专利CN107446938A公布了一种特异性靶向受体蛋白MAGEA及其CAR-T载体的构建方法，所述构建方法包括，先提取抗骨肉瘤的单克隆杂交瘤细胞的RNA，然后用单克隆抗体的特异性引物进行RT-PCR，将抗体重链和轻链的可变区DNA片段克隆到T载体上，测序，获得特异性识别肿瘤细胞的受体蛋白MAGEA，并将其表达序列克隆到CAR-T载体上，获得特异性靶向MAGEA的新型CAR-T载体。该发明能够为CAR-T细胞治疗的实体肿瘤，尤其是在骨肉瘤的免疫治疗上提供了有效的靶标。

中国专利CN107325185A公布了一种基于OCTS-CAR的PSCA及PDL1双靶向嵌合抗原受体、编码基因、OCTS-CAR-T重组表达载体及其构建方法和应用。该抗PSCA及PDL1双靶向嵌合抗原受体包括依次串联连接的CD8 leader膜受体信号肽、双抗原结合区、CD8 Hinge嵌合受体铰链、CD8 Transmembrane嵌合受体跨膜区、CD28嵌合受体共刺激因子、OX40嵌合受体共刺激因子以及TCR嵌合受体T细胞激活域，其中，双抗原结合区包括以串联或转角连接方式连接的PSCA以及PDL1单链抗体的重链VH和轻链VL、抗体内铰链Inner-Linker以及单链抗体间铰链Inter-Linker。此外，还提供了编码该抗PSCA及PDL1双靶向嵌合抗原受体的基因，重组表达载体及其构建方法和应用。