[发明专利]一种CRISPR/Cpf1系统介导的以RNA转录本为修复模板的同源重组方法

说明书

本发明公开了一种CRISPR/Cpf1系统介导的以RNA转录本为修复模板的同源重组方法。本发明以水稻ALS基因为研究对象，构建了同源重组载体。将RCR1‑RCR2‑RDR片段进行体外转录，通过RNP方法，以RNA转录本作为修复模板，在水稻愈伤中实现了目的基因的同源重组修复。同时，利用基因枪方法将载体导入水稻愈伤中，获得了ALS基因定点修饰的水稻植株。结果表明，以RNA作为修复模板可成功介导目的基因的同源重组，为农作物育种提供了新思路，因此在农业育种方面具有强大的应用潜力。

技术领域

本发明涉及一种CRISPR/Cpf1系统介导的以RNA转录本为修复模板的同源重组方法。

背景技术

CRISPR/Cpf1极大拓展了基因编辑范围，已开始应用于农作物遗传改良研究中。利用CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术进行基因敲除，已经在水稻等农作物中得到应用。但是，由于植物中同源重组频率低，利用CRISPR/Cas9介导的同源重组，在农作物中实现基因定点替换或定点整合却少有报道。目前，利用CRISPR/Cpf1系统介导的目的基因片段替换尚未有报道。

有假设提出RNA转录本可作为修复模板参与到DNA双链断裂(DSBs)导致的DNA同源重组修复(HDR)中去，而在酵母和人类细胞中，此假设已被证实。2014年，在一项酵母的研究中，RNA为修复模板介导基因组DNA的同源重组修复的有效性进一步被证实。然而，在酵母和人类细胞中，这一技术并未被广泛应用，主要由于在酵母和人类细胞中DNA修复模板可通过电转化、显微注射或转染等转化方法高效进入细胞，从而介导DNA的重组修复。但是在植物细胞中，由于细胞壁的存在，这些转化方法均不适用，尤其对于一些作物品种如：玉米、小麦、水稻等单子叶植物而言。因此在农作物中通过CRISPR/Cas系统实现目的基因的同源重组修复有很大难度，主要因为：1)在植物细胞中，DSBs主要通过非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)的方式进行修复，同源重组介导的修复(homology-directed repair，HDR)发生几率极其小；2)将修复模板转入植物细胞中的量十分有限，目前有两种方法可以提高修复模板的量，但效果仍不理想，一种方式为通过基因枪转化法将修复模板片段导入细胞内；另外一种方法是将修复模板连入病毒来源的replicon载体中，将载体转化细胞，从而增加修复模板的量。

发明内容

本发明的目的是提供一种CRISPR/Cpf1系统介导的以RNA转录本为修复模板的同源重组方法。

本发明提供了一种用于取代植物基因组中的目标片段的表达盒甲，包括启动子甲和终止子，其特征在于：在启动子甲和终止子之间包括如下三个区段：区段Ⅰ、区段Ⅱ和区段Ⅲ；区段Ⅲ为区段Ⅲ-1或区段Ⅲ-2；

区段Ⅰ中具有两个核酸酶的编码序列和一个位于它们之间的crRNA1的编码序列；

区段Ⅱ中具有两个核酸酶的编码序列和一个位于它们之间的crRNA2的编码序列；

区段Ⅲ-1中具有两个核酸酶的编码序列和位于它们之间的模板区段；

区段Ⅲ-2中具有两个靶标序列和位于它们之间的模板区段；

所述模板区段包括上游同源臂、供体片段序列和下游同源臂；

所述目标片段的一个末端为区段Ⅰ中crRNA1的靶标序列，另一个末端为区段Ⅱ中crRNA2的靶标序列；

供体片段与目标片段具有如下差异：①预期在目标片段中引入的差异核苷酸；②将crRNA1的靶标中的TTTN突变为非TTTN；③将crRNA2的靶标中的TTTN突变为非TTTN。

区段Ⅰ自5’至3’端依次具有Hammerhead型核酸酶的编码序列、crRNA1的编码序列和丁型肝炎病毒核酸酶的编码序列。