[发明专利]一种利用CRISPR/LbCpf1系统实现目的基因在植物中同源重组的方法

权利要求书

1.一种用于取代植物基因组中的目标片段的重组载体，包括如下元件甲、元件乙和元件丙；

所述元件甲包括启动子甲、区段Ⅰ和区段Ⅱ；

区段Ⅰ自5’至3’端依次具有Hammerhead型核酸酶的编码序列、crRNA1的编码序列和丁型肝炎病毒核酸酶的编码序列；区段Ⅱ自5’至3’端依次具有Hammerhead型核酸酶的编码序列、crRNA2的编码序列和丁型肝炎病毒核酸酶的编码序列；

所述元件丙自5’至3’端依次具有crRNA1的靶标序列、上游同源臂、供体片段序列和crRNA2的靶标序列；所述丙元件如序列表的序列1自5’端第7217-7765位所示；

所述元件乙为表达盒；所述表达盒中由启动子乙启动LbCpf1核酸酶的编码基因表达；

所述目标片段的一个末端为区段Ⅰ中crRNA1的靶标序列，另一个末端为区段Ⅱ中crRNA2的靶标序列；

供体片段与目标片段具有如下差异：①预期在目标片段中引入的差异核苷酸；②将crRNA1的靶标中的TTTN突变为非TTTN；③将crRNA2的靶标中的TTTN突变为非TTTN。

2.如权利要求1所述的重组载体，其特征在于：所述目标片段中，crRNA1的靶标和crRNA2的靶标之间具有限制性内切酶的识别序列；所述供体片段与目标片段的区别还包括如下④：将所述限制性内切酶的识别序列突变为非识别序列。

3.如权利要求1或2所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为序列表的序列1所示的环形质粒。

4.一种用于取代植物基因组中的目标片段的系统，包括权利要求1至3任一所述的重组载体和游离片段；所述游离片段与重组载体中的元件丙序列一致。

5.如权利要求4所述的系统，其特征在于：所述重组载体为序列表的序列1所示的环形质粒，所述游离片段如序列表的序列1自5’端第7217-7765位所示。

6.权利要求1至3任一所述重组载体，或权利要求4或5所述的系统在实现目的基因在植物中同源重组中的应用。

7.一种实现目的基因在植物中同源重组的方法，包括如下步骤：将权利要求1至3任一所述重组载体和游离片段导入出发植物，实现植物中目的基因同源重组；所述游离片段与重组载体中的元件丙序列一致。