[发明专利]一种用于检测可可球二孢的特异性引物及快速检测方法

说明书

本发明公开了一种快速检测引起多种植物病害的病原菌可可球二孢(Lasiodiplodia theobromae)的特异性引物，以及用于设计特异性引物的变异区间。根据GenBank中包括Lasiodiplodia theobromae在内的葡萄座腔菌科真菌和其它种类真菌的翻译延长因子基因(Transcription elongation factor,TEF)序列，发现了可用于设计L.theobromae特异性引物的变异区间，并基于该区间序列设计了特异性强的引物对ZYLTF1/ZYLTR1，该引物对仅可以从L.theobromae中特异扩增出一条216bp的条带，而不能从其它物种中扩增出任何条带。本发明还提供了所述引物对用于Lasiodiplodia theobromae的快速检测方法，具有特异性好、灵敏度高且经济快速等优点，此方法可快速、准确的检测出L.theobromae是否存在，能在植物病害早期防控中起到关键作用。

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测可可球二孢的特异性引物及快速检测方法。

背景技术

可可球二孢(Lasiodiplodia theobromae)生长速度快，传播能力强，对环境适应性强，其在pH 4-9、温度10-37℃范围内均可生长。该病原菌寄主范围广，能造成龙眼、猕猴桃、芒果和板栗等果实腐烂，也能引起桉树枝干溃疡病、葡萄溃疡病、橡胶木蓝变、桃树流胶病和凤梨叶斑病等多种植物病害。

植物病害的快速识别是早期防治的关键。传统的植物病害诊断方法只能在植物显现病害症状后，分离纯化病原菌并对病原菌进行鉴定才能确定病原，无法做到病害未显症时得知病原菌的侵染并及时进行防治。同时，分离病原菌后需要对病原菌进行形态或者分子鉴定，以便明确病原菌的分类地位。缺点在于，病原菌形态学鉴定易受到人为因素和培养条件的干扰导致鉴定错误。虽然近年来，基于核糖体转录间隔区序列(ITS)、翻译延长因子序列(TEF)、微管蛋白序列(BT)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)等真核生物通用基因序列已被广泛应用于植物病原真菌的鉴定。然而，利用通用引物鉴定病原菌需要分离纯化病原菌，且PCR扩增结果需送样测序及序列比对，才可确定病原菌分类地位。以上两种病原菌分类方法耗时长，程序繁琐，且常导致病害的误诊和防治延误。所以，以病害症状为基础的病害常规诊断技术不能做到病害发生前检测，难以实施提前防治，不适合快速检测的要求。因此迫切需要构建一套灵敏度高，操作简便的快速检测技术，实现植物病害的早期诊断。

利用特异性引物检测病原菌仅通过PCR扩增是否产生目标条带即可判断是否有病原菌存在，具有简便快捷和准确的优点，已经广泛的应用于病害早期诊断。

发明内容

本发明目的在于提供一种用于检测可可球二孢的特异性引物及快速检测方法。该检测方法不需要巢式PCR反应体系，可直接用总DNA为模板进行一次PCR扩增就能判定有无Lasiodiplodia theobromae，方便性得以提高。是一种很有应用前景的病原菌早期快速检测和监测技术，可为L.theobromae引起的植物病害诊断提供有力的技术保障。

本发明采取的技术方案如下：

一种用于检测可可球二孢的特异性引物对，包括上游引物ZYLTF1和下游引物ZYLTR1，所述ZYLTF1和ZYLTR1的核苷酸序列分别为：

ZYLTF1：5'-acgcatgtcgttttttaa-3'，

ZYLTR1：5'-tacatgagtggtcagagcat-3'，

所述可可球二孢的拉丁名为Lasiodiplodia theobromae。

优选的，所述引物通过以下方式得到：利用一段翻译延长因子变异区间序列设计上游引物ZYLTF1，所述变异区间序列为：acgcatgtcgttttttaacccctctcga，并根据翻译延长因子其它碱基序列设计下游引物ZYLTR1。