[发明专利]一种检测致泻病原微生物的方法

权利要求书

1.一种检测致泻病原微生物的方法，其特征在于，其包括：

以来自待测样本的总核酸提取物为模板，用第一引物对至第十引物对中的一种或几种引物对的组合进行普通PCR扩增，用第十一引物对至第十五引物对中的一种或几种引物对的组合进行RT-PCR扩增；

第一引物对用于检测沙门氏菌invA基因，其包括SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQID NO.2所示的下游引物；

第二引物对用于检测沙门氏菌ttr基因，其包括SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ IDNO.4所示的下游引物；

第三引物对用于检测痢疾菌ipaH基因，其包括SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQ IDNO.6所示的下游引物；

第四引物对用于检测霍乱弧菌ompW基因，其包括SEQ ID NO.7所示的上游引物和SEQID NO.8所示的下游引物；

第五引物对用于检测霍乱弧菌ctxAB基因，其包括SEQ ID NO.9所示的上游引物和SEQID NO.10所示的下游引物；

第六引物对用于检测副溶血性弧菌toxR基因，其包括SEQ ID NO.11所示的上游引物和SEQ ID NO.12所示的下游引物；

第七引物对用于检测副溶血性弧菌tdh基因，其包括SEQ ID NO.13所示的上游引物和SEQ ID NO.14所示的下游引物；

第八引物对用于检测副溶血性弧菌trh基因，其包括SEQ ID NO.15所示的上游引物和SEQ ID NO.16所示的下游引物；

第九引物对用于检测空肠弯曲菌hipO基因，其包括SEQ ID NO.17所示的上游引物和SEQ ID NO.18所示的下游引物；

第十引物对用于检测腺病毒，其包括SEQ ID NO.19所示的上游引物和SEQ ID NO.20所示的下游引物；

第十一引物对用于检测札如病毒，其包括SEQ ID NO.23所示的上游引物和SEQ IDNO.24所示的下游引物；

第十二引物对用于检测星状病毒，其包括SEQ ID NO.25所示的上游引物和SEQ IDNO.26所示的下游引物；

第十三引物对用于检测轮状病毒，其包括SEQ ID NO.27所示的上游引物和SEQ IDNO.28所示的下游引物；

第十四引物对用于检测诺如病毒GI型，其包括SEQ ID NO.29所示的上游引物和SEQ IDNO.30所示的下游引物；

第十五引物对用于检测诺如病毒GII型，其包括SEQ ID NO.31所示的上游引物和SEQID NO.32所示的下游引物；

各引物对中的上游引物的5’端或下游引物的5’端标记有用于与催化酶结合的第一亲和物。

2.根据权利要求1所述的检测致泻病原微生物的方法，其特征在于，在普通PCR扩增或者是RT-PCR扩增的反应体系中，各引物对的上游引物与下游引物的摩尔比大于1，或者各引物对的下游引物与上游引物的摩尔比大于1。

3.根据权利要求2所述的检测致泻病原微生物的方法，其特征在于，在普通PCR扩增或者是RT-PCR扩增的反应体系中，各引物对的上游引物与下游引物的摩尔比为1.1-1.5，或者各引物对的下游引物与上游引物的摩尔比为1.1-1.5。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，在PCR扩增反应之后，所述方法还包括：杂交步骤；

所述杂交步骤包括：将由普通PCR扩增反应得到的反应产物和由RT-PCR扩增反应的反应产物混合后与膜芯片反应，进行杂交处理；

其中，所述膜芯片上固定有碱基序列如SEQ ID NO.35-49所示的探针中的一种或多种。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述杂交处理的条件包括：温度为44-46℃、转速为80-100rpm以及时间为40-50min。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在进行杂交处理之前，所述杂交步骤还包括去活化处理；

所述去活化处理包括：

用去活化液对所述膜芯片进行孵育，36-38℃孵育8-10min；然后用去活化清洗液对所述膜芯片进行孵育，58-62℃孵育4-6min。