[发明专利]一种咖啡黄葵ISSR-PCR反应体系

说明书

本发明公开了一种咖啡黄葵ISSR‑PCR反应体系，20μl反应体积中包括：模板DNA 40ng，引物1.0μmol/L，dNTPs 0.25mmol/L，TaqDNA聚合酶0.5U，Mg²⁺2.5mmol/L，10×PCR Buffer 2μl；扩增反应按如下程序进行：94℃预变性5min；94℃变性1min，48～60℃退火1min，72℃延伸90s，循环40次；72℃延伸10min。本发明较为细致地进行了咖啡黄葵ISSR‑PCR反应体系的优化工作，确定了咖啡黄葵ISSR‑PCR的最佳反应体系，可用于咖啡黄葵的种质资源遗传多样性研究、种子纯度鉴定、杂交后代杂种真实性鉴定、遗传图谱构建等。

技术领域

本发明涉及生物技术领域。

背景技术

咖啡黄葵，学名Abelmoschus esculentus(Linn.)Moench，亦称黄秋葵，是锦葵科秋葵属一年生草本植物，在热带以及亚热带地区广泛种植。咖啡黄葵的果实富含多种营养成分，食用价值极高，作为一种保健蔬菜受普罗大众所欢迎，提取出的果胶还能用于食品加工或其他工业产品。对咖啡黄葵种质资源进行遗传多样性及亲缘关系的研究有助于咖啡黄葵的鉴定、分类、选育等。国内外已有少量运用RAPD、SRAP、ISSR及SSR等分子标记技术对咖啡黄葵种质进行分析的研究。其中，ISSR分子标记技术同时具备SSR、RAPD等标记技术的优良特性，与SSR相比，该技术不需序列信息，同一套ISSR引物可作用于多种植物；与RAPD相比，ISSR重复性更高，稳定性更好，兼备RAPD的操作简便的特性，因此相比其他技术，ISSR的省时便捷、低成本、节省DNA用量、安全高效等优势尤为明显。然而，咖啡黄葵ISSR-PCR体系的优化研究尚未见报道，为了提高咖啡黄葵ISSR-PCR实验结果的清晰度、稳定性、重复性，同时降低长期科研工作的成本，必须优化咖啡黄葵ISSR-PCR体系。

发明内容

本发明提供了一种咖啡黄葵ISSR-PCR反应体系。

咖啡黄葵ISSR-PCR反应体系，20μl反应体积中包括：模板DNA40ng，引物1.0μmol/L，dNTPs 0.25mmol/L，TaqDNA聚合酶0.5U，Mg²⁺2.5mmol/L，10×PCR Buffer 2μl；扩增反应按如下程序进行：94℃预变性5min；94℃变性1min，48～60℃退火1min，72℃延伸90s，循环40次；72℃延伸10min。具体退火温度根据所用引物确定。

本发明提供的咖啡黄葵ISSR-PCR反应体系，扩增产物条带清晰、丰度高，稳定性好，可用于咖啡黄葵的种质资源遗传多样性研究、种子纯度鉴定、杂交后代杂种真实性鉴定、遗传图谱构建等。

附图说明

图1是ISSR-PCR正交试验1～4号处理的产物电泳图；标号M为100～3000bp LadderDNA Maker；标号1～4分别为SEQ ID№1所示引物在1～4号处理体系中对“红星”的扩增条带；标号5～8分别为SEQ ID№2所示引物在1～4号处理体系中对“红星”的扩增条带；标号9～12分别为SEQ ID№1所示引物在1～4号处理体系中对“华宝”的扩增条带；标号13～16分别为SEQ ID№2所示引物在1～4号处理体系中对“华宝”的扩增条带；

图2是ISSR-PCR正交试验5～8号处理的产物电泳图；标号M为100～3000bp LadderDNA Maker；标号1～4分别为SEQ ID№1所示引物在5～8号处理体系中对“红星”的扩增条带；标号5～8分别为SEQ ID№2所示引物在5～8号处理体系中对“红星”的扩增条带；标号9～12分别为SEQ ID№1所示引物在5～8号处理体系中对“华宝”的扩增条带；标号13～16分别为SEQ ID№2所示引物在5～8号处理体系中对“华宝”的扩增条带；