[发明专利]构建Doxycycline/Mifepristone诱导过表达的带有荧光蛋白标记基因的双诱导表达载体

权利要求书

1. 一种构建Doxycycline/Mifepristone诱导过表达的带有荧光蛋白标记基因的双诱导表达载体，其特征在于：所述表达载体系统核苷酸序列如SEQ ID NO.1, NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的一种构建Doxycycline/Mifepristone诱导过表达的带有荧光蛋白标记基因的双诱导表达载体的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）以pSwitch为模板构建载体PB-Gal4-Teton-trans-vector的反式载体；

（2）以GeneV5-His B为模板构建顺式表达载体PB-Gal4-Teton-cis-vector；

（3）将以上步骤（1）和步骤（2）载体和其它辅助载体（PB200PA-1）载体组合在一起构建成一套双诱导过表达载体系统。

3.根据权利要求2所述的一种构建Doxycycline/Mifepristone诱导过表达的带有荧光蛋白标记基因的双诱导表达载体的构建方法，其特征在于：具体包括以上步骤：

步骤一、反式元件载体PB-Gal4-Teton-trans-vector的构建：

以pSwitch为模板，设计引物Switch-5’和Switch-3’扩增pSwitch的反式元件表达框Gal4+TK mini pro +DBD/p65/AD fusion protein +BGH polyA，磷酸化后正向插入PB-teton-OE的衍生载体PB-teton-Mir的SfiI和EcoRI位点之间，从而构建含有Tet-on系统和Gal4/RU486系统反式元件表达框PB-Gal4-Teton-trans-vector；

步骤二、顺式表达载体PB-Gal4-Teton-cis-vector-basic的构建：

以GeneV5-His B为模板，设计引物Switch-5’-MluI和BGH PA-3’扩增的顺式元件表达框Gal4-MCS-BGH polyA, 引物SV40 Pro-5’和SV40 PA-3’扩增G418抗性基因表达框 SV40early pro +Zeocin resist gene +SV40 polyA +terminator，两个DNA片段进行融合PCR扩增，其产物的5’被MluI酶切，3’被磷酸化后插入PB-teton-OE的MluI和HpaI之间，从而构建含有Tet-on系统和Gal4/RU486系统顺式元件表达框的PB-Gal4-Teton-cis-vector-basic；

步骤三、顺式表达载体PB-Gal4-Teton-cis-vector的构建：

以含有mCherry CDS +P2A的质粒为模板设计引物mCherry-HindIII-5’和mCherry -3’扩增其CDS，5’被MluI酶切，3’被磷酸化后后插入PB-Gal4-Teton-cis-vector-basic的HindIII和PmeI之间，构建成PB-Gal4-Teton-cis-vector；

步骤四、将以上其它步骤中载体与其它载体组装在一起构建表达载体系统。

4.根据权利要求1所述的构建Doxycycline/Mifepristone诱导过表达的带有荧光蛋白标记基因的双诱导表达载体在293T细胞系上的应用。

5.根据权利要求4所述的构建Doxycycline/Mifepristone诱导过表达的带有荧光蛋白标记基因的双诱导表达载体的应用，其特征在于：所述293T细胞系受盐酸强力霉素和米非司酮的双重诱导。

6.根据权利要求4所述的双诱导带荧光蛋白标记表达载体的应用，其特征在于：所述盐酸强力霉素 1 μg/ml，米非司酮 10nM。