[发明专利]一种鸭卵巢卵泡膜层细胞的分离培养方法

说明书

本发明公开了一种鸭卵巢卵泡膜层细胞的分离及培养方法，其分离及培养方法如下：将鸭颈部放血处死，取出卵巢，用磷酸盐缓冲液冲洗血污；剥离卵泡外层结缔组织与血管网；在卵泡柄对面无血管区域划开卵泡，倒出、洗净卵黄与颗粒细胞，仅保留膜层细胞；胰蛋白酶水浴消化；加入胎牛血清终止消化，并用磷酸盐缓冲液反复清洗；剪碎组织，用胶原酶等消化液水浴消化；使用冰冷磷酸盐缓冲液冲终止消化；过滤，离心，使用含10％胎牛血清的改良杜氏伊格尔培养基重悬细胞液；接种至细胞培养皿中；培养6h换液，置于培养箱继续培养。本发明获得的鸭卵巢卵泡膜层细胞纯度高，贴壁紧密，细胞形态正常，活性良好，培养方法稳定可靠，可重复性强。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及卵巢细胞分离及体外培养技术，尤其涉及一种鸭卵巢卵泡膜层细胞的分离及培养方法。

背景技术

我国作为鸭养殖和消费的大国，蛋、肉鸭养殖及鸭蛋加工是我国传统优势畜牧产业,鸭养殖产业近十年来总体发展平稳。研究发现，鸭卵巢卵泡生长发育情况对其产蛋性能及其蛋品质有着直接的影响。鸭的卵泡数以万计，随着性成熟的到来，卵泡依次迅速发育，并处于不同的发育阶段，进而形成严格的等级体系。卵泡的发育过程通常分为原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡与成熟卵泡。

卵泡膜层细胞，起源于卵巢成纤维样基质细胞，包括卵泡内膜细胞和外膜细胞，是卵泡的重要组成部分。卵泡膜层细胞与卵泡发育密切相关，卵泡膜层的出现标志着次级卵泡的形成。卵泡膜层形态特征随着卵泡发育阶段的变化而变化，是判别卵泡发育阶段的重要标志。另外，在生理方面，膜层细胞通过调控多种生长因子与颗粒细胞，卵母细胞互作，进而共同调控卵泡的生长发育。类固醇激素在卵泡发育过程中扮演着重要的角色，研究表明，在等级前卵泡中，颗粒细胞没有合成孕酮的能力，此时，卵泡所需的所有类固醇激素几乎都由膜层细胞进行合成；即使在等级卵泡中，膜层细胞也能为卵泡提供雄激素与雌激素。综上，我们可以发现，卵泡膜层细胞对于整个卵泡发育过程都有十分重要的意义。

但目前对卵泡膜层细胞体外培养的研究与报道十分有限，尤其是在禽类上，并没有形成规范而可靠的膜层细胞体外培养模型。因此，建立一个可靠的鸭卵泡膜层细胞分离，鉴定，培养模型，对探究膜层细胞的特性，明确其在卵泡发育的地位与具体作用机制，进而改善禽类产蛋性能、提高其蛋品质有着重要的意义。

发明内容

本发明旨在针对现有技术在禽类上没有可靠的膜层细胞体外培养模型，建立了一种鸭卵巢卵泡膜层细胞的分离及培养方法，弥补了这一方向上空白，本发明方法获得的鸭卵巢卵泡膜层细胞具有纯度高、可重复性强的特点。

本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明公开的一种鸭卵巢卵泡膜层细胞的分离及培养方法，具体包括以下步骤：

1)选取健康的产蛋期连城白鸭母鸭颈部放血处死，用75％酒精棉擦拭干净后剪开腹部皮肤取出卵巢及卵泡，再用PBS缓冲液冲去血污，将干净的卵巢卵泡放入装有PBS缓冲液的烧杯中，迅速转入细胞培养室中；

2)取出卵巢组织，将等级卵泡取出，剥净外层的结缔组织和血管网，用PBS缓冲液洗净血污放入装有PBS缓冲液的培养皿；

3)沿卵泡表面柄对面的无血管区划开1～2cm小口，去除卵黄及颗粒细胞后将卵泡膜层反转，在PBS缓冲液中反复清洗，直至卵黄及颗粒细胞被洗尽；

4)加入胰蛋白酶消化液，在37℃水浴中振荡孵育10min后，加入胎牛血清终止消化，用PBS缓冲液洗净胰蛋白酶消化液；

5)将膜层组织剪碎，加入酶消化液，转入37℃水浴中振荡孵育20min；

6)使用PBS缓冲液稀释酶消化液，转移含膜层细胞的酶消化液过不锈钢细胞网筛，并用PBS缓冲液冲洗网筛；

7)将细胞液转移至离心管，以800g离心10min，弃去上清液，使用改良DMEM培养液将细胞重悬后分装，放入培养箱中培养；