[发明专利]一种用于肠道中双歧杆菌属定量的引物及定量方法

说明书

本发明比对目前已经完成全基因组测序的所有双歧杆菌的全基因序列，以其单拷贝核心基因rp1N为目的序列设计引物，通过琼脂糖凝胶电泳进行初筛、微滴式数字PCR进行复筛，筛选出一对特异性较好的双歧杆菌属引物。这对引物可以特异性的“识别”出粪便样品等复杂样品中的双歧杆菌。

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种用于肠道中双歧杆菌属定量的引物及定量方法。

背景技术

双歧杆菌是存在于人和动物的胃肠道中的一种革兰氏阳性厌氧菌。它最早分离自母乳喂养婴儿的粪便。目前包含69个确定种。作为肠道微生物的内源成员或作为异源益生菌物种，双歧杆菌通常被认为具有促进健康的作用，因此被广泛应用于食品和益生产品中。而且在上世纪初就认为双歧杆菌是人与微生物相互作用中的关键共生体，并认为其在维持健康的胃肠道中起着关键的作用。随着生物技术的发展，越来越多的、存在于肠道中的微生物被发现，但是双歧杆菌依然是健康评估的关键指标之一。

张海波等收集83例足月出生婴儿出生3天内每天的粪便，通过real-time PCR对粪便中的双歧杆菌属进行定量，结果发现剖宫产婴儿粪便中的双歧杆菌属低于自然分娩组的，进而得出剖宫产影响了婴儿早期肠道菌群的正常定植(剖宫产对新生儿出生后3d内肠道双歧杆菌和乳酸杆菌定植的影响)。Wang等通过real-timePCR对腹膜透析病人的粪便中的双歧杆菌属等进行定量，发现腹膜透析病人粪便中的双歧杆菌数量明显低于健康对照组的。进而推断肠道微生物失衡可能会导致肠道屏障功能受损，宿主易受病原体侵入(Real-Time PCR Analysis of the Intestinal Microbiotas in Peritoneal DialysisPatients)。Zheng等研究发现，患有湿疹的婴儿的肠道中双歧杆菌含量明显低于健康婴儿的(Altered Gut Microbiota Composition Associated with Eczema in Infants)。而Takahiro等人通过Real-Time PCR分析人类粪便中的主要细菌时，也将双歧杆菌属就作为主要分析菌属之一(Use of 16S rRNA Gene-Targeted Group-Specific Primers forReal-Time PCR Analysis of Predominant Bacteria in Human Feces)。

目前用于双歧杆菌属定量的引物大部分基于其16S rRNA基因序列，早期设计的引物由于双歧杆菌测序种类有限，仅以部分双歧杆菌16S rRNA基因序列为目的序列，无法包括所有双歧杆菌，不具有代表性。后期以双歧杆菌管家基因或者某些功能基因为目的基因序列设计引物，但是这些基因往往不是双歧杆菌属特有的基因序列，无法确保其引物的特异性。还有某些功能基因在不同双歧杆菌中的拷贝数不同，无法保证定量结果的准确性。因此，需要特异性较好的双歧杆菌属引物，并定量检测粪便样品等复杂样品中的多种双歧杆菌。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于肠道中双歧杆菌属定量的引物，其中所述引物的上游序列为SEQ ID NO1.ATCAATGATTCAGCAGGAAACGC，下游序列为SEQ IDNO2.GTTCTCGTCGAACTTGATGTAGG。

优选地，本发明所述的用于肠道中双歧杆菌属定量的引物中，所述引物的PCR扩增片段大小约250bp。

优选地，本发明所述的用于肠道中双歧杆菌属定量的引物中，所述引物的PCR扩增最佳退火温度为60℃。

本发明的另一方面为提供一种构建用于定量肠道中双歧杆菌属引物的方法，包括以下步骤：

1)引物设计：

比对已经完成全基因组测序的所有双歧杆菌基因序列，寻找其共有核心基因，筛选出单拷贝核心基因，以单拷贝核心基因为目的序列设计引物；

2)引物初步筛选：