[发明专利]一种食源性致病菌现场快速检测方法

权利要求书

1.一种食源性致病菌现场快速检测方法，其特征在于：

步骤一、筛选得到常见食源性致病菌适配体，测定适配体与靶标的特异性和亲和力，拟合解离常数曲线；并合成与适配体对应的互补寡核苷酸单链；

步骤二、利用高温共沉淀法，获得AReF₄:Yb,Er上转换荧光纳米微粒；将1.0 mmolReCl₃·6H₂O加入到按一定比例混合的油酸、十八烯反应体系中，反应体系抽真空并加热至140-160℃保温40-90 min；反应体系冷却至25-50℃，加入溶解于甲醇中的NH₄F、AOH溶液 ，其中A为Li/Na，室温搅拌反应30-120 min；反应体系加热至80-120℃，通大气流量的惰性气体Ar、N₂排甲醇20-40 min；甲醇排尽后反应体系持续升温至300℃，保温60-120 min；冷却至室温，加入适量无水乙醇沉淀，6000-10000 rpm离心，洗涤；步骤三、利用配体交换法在UCNPs表面修饰氨基，获得氨基修饰的UCNPs，使用无水乙醇和去离子水洗涤2-4次；

其中Re为Y/Gd/Lu；Yb；Er；

步骤四、利用EDC/Sulfo-NHS作为偶联剂，先活化致病菌适配体的羧基端30-60 min，再加入适量氨基修饰的UCNPs，室温搅拌16-24 h；离心、洗涤得到Aptamer-UCNPs纳米探针；采用相同的方法将与适配体对应的互补寡核苷酸单链与AF546荧光染料进行共价偶联得到AF546-cDNA；

步骤五、将一定量Aptamer-UCNPs纳米探针和AF546-cDNA加入到1-3 mL杂交缓冲液中，室温搅拌20-60 min，通过碱基互补配对获得AF546-cDNA/Aptamer-UCNPs纳米复合物；使用980 nm便携式半导体激光器激发纳米复合物溶液，利用普通数码相机拍照记录纳米复合物荧光发光图片；

利用荧光光谱仪测定纳米复合物荧光光谱，分别积分计算510-560 nm、640-680 nm波段的荧光强度G_510-560和R_640-680，得到两个波段的荧光强度比值GRR=G_510-560/R_640-680；构建致病菌检测体系，在6组一定浓度的AF546-cDNA/Aptamer-UCNPs纳米复合物分散液中，分别以一定浓度梯度加入与Aptamer对应的食源性致病菌，室温共孵育20-40 min；由于竞争关系，致病菌与Aptamer-UCNPs结合，AF546-cDNA从AF546-cDNA/Aptamer-UCNPs纳米复合物脱离下来，使得AF546-cDNA与Aptamer-UCNPs之间的荧光共振能量转移现象不存在，UCNPs的510-560 nm波段的荧光强度G_510-560得到恢复，且荧光强度G_510-560恢复的程度与致病菌浓度呈正相关；在检测过程中，由于UCNPs的510-560 nm波段的荧光强度G_510-560与致病菌浓度相关，而640-680 nm 波段的荧光强度R_640-680在致病菌检测过程中基本保持不变；因此，UCNPs的两个波段荧光强度比值GRR=G_510-560/R_640-680也与致病菌浓度呈正相关，肉眼观察时即表现为检测体系的荧光颜色变化与致病菌浓度相关；又可利用荧光光谱仪测定检测体系荧光强度变化，建立荧光强度GRR与致病菌浓度的标准曲线，用以定量测定待测样品中的致病菌浓度。

2.根据权利要求1所述的一种食源性致病菌现场快速检测方法，其特征在于：所述步骤一，利用whole-bacteria SELEX技术筛选得到常见食源性致病菌适配体。

3.根据权利要求1所述的一种食源性致病菌现场快速检测方法，其特征在于：所述步骤三，将聚丙烯胺加入到10-20 mL二甘醇中，通氩气保护并加热至100℃以上，聚丙烯胺充分溶解；再逐滴加入10 mL分散有适量UCNPs的环己烷分散液；保温20-40 min排尽环己烷后，持续升温至220-240℃，保温60-240 min；冷却至室温，加入适量0.1 M的HCl溶液，12000-15000 rpm离心10-30 min。