[发明专利]一种微生物发酵类胡萝卜素制备二氢猕猴桃内酯的方法

权利要求书

1.一种微生物发酵类胡萝卜素制备二氢猕猴桃内酯的方法，其特征在于，步骤如下：

（1）制备保藏号为M2017593菌株的菌种发酵液：其中所述菌种具体为中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号：M2017593；名称：Bacillus altitudinis SH161；保藏日期：2017年10月19日；地址：中国.武汉.武汉大学；邮编：430072；

（2）取步骤（1）制备的菌种发酵液经过滤、离心后加硫酸铵，静置后透析，然后进行纯化得到馏分，经洗脱过滤得粗酶液；

（3）向类胡萝卜素中添加0.5%wt-2.0%wt粗酶液，在30-35℃下，催化反应10-20h，得初级产物菌液；

（4）初级产物菌液经过滤、3-5次萃取后用饱和的碳酸氢钠洗涤，再经无水硫酸钠干燥后得二氢猕猴桃内酯。

2.如权利要求1所述的微生物发酵类胡萝卜素制备二氢猕猴桃内酯的方法，其特征在于，所述步骤（1）的具体操作为：

a. 菌种活化从保藏培养基上挑取发酵菌株，接种到活化培养基中活化培养48h-72h；

b. 将步骤a中活化后的菌种接种到种子培养基中，28-30℃、160 r/min摇床培养36h-48h左右，制备种子液；

c. 将步骤b中所制备的种子液接种到发酵培养基中，28-30℃、160 r/min摇床培养48h-72h发酵培养。

3.如权利要求1所述的微生物发酵类胡萝卜素制备二氢猕猴桃内酯的方法，其特征在于，所述步骤（2）的具体操作为：

a. 将菌种发酵液采用常压过滤，过滤后的发酵液经离心得澄清的初级粗酶液，向初级粗酶液中加入硫酸铵至硫酸铵的饱和度为70%，于4℃下静置过夜后，10000pm，4℃条件下离心20 min，取上清酶液；

b. 将步骤a中得到的上清酶液进行盐析透析，将透析所得的透析粗酶液加入预先处理好的透析袋中，使透析粗酶液占透析袋的2/3，然后排净透析袋的空气，两端封闭，放入pH7.4的磷酸缓冲溶液中在4℃下透析，每隔6 h更换缓冲溶液一次，透析24-48 h，得透析液；

c. 将透析液进行DEAE-Sepharose离子交换洗脱得洗脱酶液Ⅰ，将洗脱酶液Ⅰ在4℃下，用0.1-0.5 mol/L的NaCl盐溶液以2.0 mL/min流速于预装好的DEAE-Sepharose-F.F.离子交换柱上进行阶段性洗脱，每3mL收集一管洗脱酶液Ⅱ，于4℃保存备用；

d. 将步骤c得到的洗脱酶液Ⅱ进行Sephadax G-100凝胶过滤，将10 mmol/L、pH为6.5的Na₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液以0.3 mL/min的流速进行洗脱，每3mL收集一管洗脱酶液Ⅲ，于4℃保存备用，即得目的粗酶液。

4.如权利要求3所述的微生物发酵类胡萝卜素制备二氢猕猴桃内酯的方法，其特征在于：所述步骤b中的透析液与外界溶液的pH、电导率和平衡缓冲液一致。

5.如权利要求1所述的微生物发酵类胡萝卜素制备二氢猕猴桃内酯的方法，其特征在于，所述步骤（4）中萃取的具体操作为：采用二氯甲烷进行萃取，萃取分3-5次完成，第一次萃取时轻微振荡，每隔3 min振荡一次，共振荡三次；第二次到第五次萃取时剧烈振荡，振荡至有泡沫出现，每隔3 min振荡一次，共振荡三次。

6.如权利要求1所述的微生物发酵类胡萝卜素制备二氢猕猴桃内酯的方法，其特征在于，所述步骤（4）中制得的二氢猕猴桃内酯的产品收率为1.0mg/L-2.0 mg/L，纯度9%-11%。