[发明专利]肝病T细胞功能的检测评估方法及试剂盒

权利要求书

1.一种肝病T细胞功能的检测评估方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)利用单个细胞通过流式细胞仪，使用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定标记组合，检测不同细胞因子的分泌，根据不同的标记获取结果；所述抗细胞因子抗体带有颜色的荧光标记的化合物，能够清楚地区分无分泌相应细胞因子的免疫细胞；

2)利用大数据生物统计学分析技术，对每一个细胞因子对造成整体免疫功能的贡献/作用/影响进行判读，根据数据模型，最终形成对整体免疫功能的判读。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述抗体为以下多种：CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞表达的IFN-γ、IL-2、TNF-α、CTLA-4、Tim3、2B4、PD-1、LAG3。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)具体包括：PBMC分离培养；流式细胞术检测T细胞表面共抑制分子；流式细胞术检测T细胞胞内因子。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述PBMC分离培养包括以下步骤：

1)采EDTA抗凝血20ml；离心，500g，8min，升9，降9，分离血浆，标记，血浆-80℃保存待用，血细胞层留用；稀释：将血细胞移至50ml离心管，加PBS至约30ml，并吹打均匀；

2)取4支15ml离心管，每管加4.5ml淋巴细胞分离液，然后将血液加至所述分离液上面；

3)无刹车密度梯度离心：25℃，450g，25min，升5，降0；

4)取出试管，见其分为以下四层：上层为PBS及部分剩余血浆，即血浆层，下层为红细胞及粒细胞；中层为淋巴细胞分离液，在淋巴细胞分离液与血浆层之间可见白膜层，吸取白膜层细胞，以1：5体积比，用PBS洗涤细胞2次，500g，8min；

5)沉淀细胞加入培养基重悬，用2％的苔盼蓝染色，证实活细胞数在95％以上，调密度为1*e7/ml。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述流式细胞术检测T细胞表面共抑制分子包括以下步骤：

1)流式抗体的使用量为2-5μl，每只流式管取用RPMI 1640+10％FBS完全培养基重悬的细胞1*e5个；

2)4℃，400g，8min离心，弃上清，倒置吸水，利用管中残余的液体弹匀细胞；加入带有各自荧光标记的抗体：CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞表达的IFN-γ、IL-2、TNF-α、CTLA-4、Tim3、2B4、PD-1、LAG3各2μl，4℃孵育30min，隔15min弹匀一下；

3)加入PBS 1ml洗1次，4℃，400g，8min，弃上清，倒置吸水；120μl PBS+40μl 4％PFA涡旋器上立刻重悬，固定；

4)上机检测。