[发明专利]一种用于多重聚合酶链反应检测的液滴

说明书

本发明公开了一种用于多重聚合酶链反应检测的液滴，包括一般内容物、表面和特征物；所述一般内容物分布于液滴内部，为聚合酶链反应提供反应条件；表面包裹于液滴外部，形成稳定的液滴界面；特征物位于液滴的内部，是生物反应相容的固体材料，在固体材料表面固载有模板分子链，该模板分子链可通过聚合酶链反应被放大信号，用于实现核酸分子的定性检测或者定量检测；本案中，每个微滴类似于单重PCR的一个管，每个微滴的扩增反应是相对独立的，能有效改善传统多重PCR反应体系较大而存在相互干扰的问题，是一种非常有效的多重核酸扩增方法。

技术领域

本发明属于分子检测领域，具体涉及一种用于多重聚合酶链反应检测的液滴。

背景技术

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)技术是目前应用最广泛的核酸检测技术，其主要优势在于简便、稳定，而且应用基础好。多重PCR的原理是在反应体系内同时加入多对特异性引物，同时扩增出多条目的DNA片段，由于各引物的扩增片段的大小存在明显差异，根据产物的片段大小或利用分子杂交以实现多个微生物的同时检测。自1988年首次提出多重PCR这个概念，经过多年的发展，多重PCR技术逐渐成熟。

但PCR技术的主要局限在于多重基因检测可涵盖的靶基因数量有限，要实现多重检测往往需要多管来实现。虽然目前有些方法能够实现多重检测，但仍然存在一些问题。现有的多重检测技术都是先经过多重PCR扩增，这种多靶标的扩增有以下问题：特异性和灵敏度不理想；某一特定片段有限扩增；由于多重PCR反应体系中同时存在几对引物，使得形成引物二聚体的几率增大；如果非特异性产物优先扩增，将会大量消耗反应底物，降低特异性扩增效率。针对上述问题，许多学者开发了多种新型的多重PCR技术，如双启动寡核苷酸引物、多重连接依赖式探针扩增、特异性目标延伸、靶序列富集多重PCR、巢式PCR等，这些技术在某些方面使多重基因检测有一定的提高，但还是存在很多问题。目前对多重PCR的检测手段主要有毛细管电泳(或凝胶电泳)、液相芯片、质谱等方式，不管以何种方式检测，前期的多重扩增质量会直接影响检测结果。

发明内容

针对现有技术中存在的不足之处，本发明的目的在于提供一种用于多重聚合酶链反应检测的液滴，以降低多重PCR反应中多种探针的非特异性杂交反应，同时避免竞争反应所导致的底物不足问题。

本案提供了一种用于多重聚合酶链反应检测的液滴，包括一般内容物、表面和特征物；

其中，所述一般内容物分布于液滴内部，包括聚合酶链反应引物、脱氧核糖核苷三磷酸、酶、生物探针、金属离子，为聚合酶链反应提供反应条件；

所述表面包裹于液滴外部，形成稳定的液滴界面，该表面可由同种或不同种特定成分形成，不易破裂，便于扩增、拾取、转移等后续操作；

所述特征物位于液滴的内部，是生物反应相容的固体材料；所述固体材料表面固载有模板分子链；所述模板分子链通过聚合酶链反应被放大信号，用于定性检测或者定量检测。

优选的是，所述的液滴，其特征在于，所述液滴的体积为常规聚合酶链反应反应体系的1/1000-1/10000000，典型液滴的体积为0.01纳升-100纳升。

优选的是，所述特征物为编码微粒，每个液滴中最多含有一个编码微粒，每个编码微粒与单一种属的模板分子链偶联，形成映射关系；其中，所述模板分子因碱基序列不同为相异种属；所述每个编码微粒具有各自的编码特征。

优选的是，所述液滴用于同一反应体系中多重聚合酶链反应的反应物检测，通过编码微粒的编码特征来确定模板分子链的种属；通过在模板分子链上发生的PCR反应使信号被放大而易于检测，并定性其为阳性(结合了目标模板分子链而发生了特异性PCR)或阴性(未结合目标模板分子链而没有发生特异性PCR反应)，以及通过分子探针的荧光等特性定量分析分子链的数量。