[发明专利]利用重组水泡性口炎病毒构建预防猪流行性腹泻病毒疫苗

说明书

本发明公开了利用重组水泡性口炎病毒(VSV)构建预防猪流行性腹泻病毒(PEDV)疫苗；包括：借助基质蛋白(Matrix,M)三个不同氨基酸位点发生突变的高度弱化的VSV(VSV_MT)表达PEDV2012年上海株保护性抗原S蛋白来制备得到的预防PEDV的新型疫苗。该重组病毒体外复制滴度可接近10⁹TCID₅₀/ml；在猪体内，该新型疫苗可高效诱导中和保护性抗体，同时，鉴于以VSV为平台构建的重组疫苗具备快速激活动物机体免疫保护力的特点，表达PEDV保护性抗原的VSV疫苗可成为有效预防猪流行性腹泻病毒的应急免疫疫苗。

技术领域

本发明涉及一种利用重组水泡性口炎病毒(VSV)构建预防猪流行性腹泻病毒疫苗。

背景技术

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征的一种高度接触性肠道传染病(Pensaert et al.，1978)，PEDV是一种动物冠状病毒，该病毒可致各年龄段猪感染，但仔猪发病率通常为100％，母猪为15％～90％，其中，该病毒对新生仔猪致死率可达50％以上，2011年以来，PEDV在我国的大范围流行给养殖业造成了极大经济损失。PEDV所致病程急，传播速度快，因此及时针对疫区和周边地区的猪群尤其是初生仔猪和待产母猪进行紧急预防接种，使之快速产生免疫保护力，对于控制疫情蔓延，降低仔猪死亡率极为关键。虽然PEDV疫苗已在国内广泛应用，但是PEDV在国内各地猪场的流行仍较普遍。

目前预防PEDV所使用的商品化疫苗存在以下缺点：

1、主要为灭活疫苗，需多次接种动物，形成免疫保护力较慢，不适合在疫情出现时应急接种之用；

2、灭活苗的另一个缺点是无法有效激发宿主产生特异性CTL及粘膜免疫应答。利用PEDV减毒活疫苗是克服这些困难的方法之一，但由于冠状病毒基因可在自然条件发生重组，因此难以保证其使用的安全性，欧美国家禁止使用减毒活疫苗预防PEDV；

3、目前PEDV的制备主要通过Vero细胞体外培养获得，复制滴度较低(约10⁶-10⁷TCID₅₀/ml)，细胞培养液需加入一定量的胰酶才能维持病毒体外扩增，这在一定程度上限制了该病毒的大规模制备。

鉴于现有疫苗存在的问题，急需研究新型的PEDV疫苗。

重组水泡性口炎病毒(VSV)作为疫苗载体具有独特优势，已经得到很好应用。借助基因工程减毒病毒载体表达外源抗原是研制新型疫苗的一种有效方式，其中重组水泡性口炎病毒(VSV)已在人用应急疫苗研制和应用上取得突破，新近的报道表明，利用重组水泡性口炎病毒(VSV)为载体制备的Ebola病毒应急疫苗，可在3-5天内激发灵长动物体内有效免疫保护力，免疫动物可经受住致死剂量病毒的攻击，该疫苗即将完成人体实验，投入临床应用。

VSV作为疫苗载体的主要优点包括：

1、许多研究证实，作为疫苗载体，VSV可以成为表达外源抗原蛋白，如HIV、埃博拉病毒(Ebola)等的高效平台；

2、VSV复制周期短(约8小时复制一代)，易于培养，扩增病毒所用BHK21细胞可高密度悬浮培养，这为以VSV为平台制备的重组疫苗进行工业化、规模化生产提供了得天独厚的优势；

3、VSV重组疫苗除了可有效激发肌体产生全面的免疫应答，包括细胞免疫应答、体液免疫应答和粘膜免疫应答之外，还具有快速激发免疫应答的优点，如：以VSV为载体制备的Ebola病毒应急疫苗，已证实可在接种灵长动物3-5天内激发免疫保护力。

鉴于VSV作为疫苗载体所具备的诸多优点，本申请拟利用其研制针对仔猪和成年猪的PEDV应急免疫疫苗。

发明内容