[发明专利]用于检测口蹄疫病毒和塞尼卡谷病毒的实时荧光定量RT-PCR试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种用于检测口蹄疫病毒和塞尼卡谷病毒的一步直扩Taqman实时荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于，包含分别用于检测口蹄疫病毒以及塞尼卡谷病毒的引物以及探针，其中用于检测塞尼卡谷病毒的引物由上游引物和下游引物组成，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；用于检测口蹄疫病毒的引物由上游引物和下游引物组成，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

2.如权利要求1所述的Taqman实时荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包含核酸提取液、2×Direct qRT-PCR Mix、酶混合液、阳性对照以及阴性对照。

3.如权利要求1所述的Taqman实时荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述探针的5’端标记荧光报告基团；所述探针的3’端标记小沟结合物和荧光淬灭基团。

4.如权利要求1所述的Taqman实时荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于，用于检测口蹄疫病毒以及塞尼卡谷病毒的引物以及探针按照摩尔比1:1:1:1:1:1混合，其终浓度均为10pmol/μL。

5.如权利要求1所述的Taqman实时荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于，用于检测塞尼卡谷病毒的探针的5’端标记荧光报告基团HEX；所述探针的3’端标记小沟结合物MGB和荧光淬灭基团BHQ-1，用于检测口蹄疫病毒的探针的5’端标记荧光报告基团FAM；所述探针的3’端标记小沟结合物MGB和荧光淬灭基团BHQ-1。

6.如权利要求1所述的Taqman实时荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述的核酸提取液按照以下方法制备得到：将异硫氰酸胍25g溶于33ml CSB缓冲液中，混合至完全溶解，其中CSB缓冲液中含有：42mM柠檬酸钠；0.83％w/v N-lauryl sarcosine(十二烷基肌氨酸钠)；0.2mMβ-巯基乙醇。

7.如权利要求1所述的Taqman实时荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照为含有SEQ ID NO.7以及SEQ ID NO.8所示序列的质粒，所述的阴性对照为无RNA酶水。

8.如权利要求1-7任一项所述的Taqman实时荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于，用于检测口蹄疫病毒和塞尼卡谷病毒时，按照以下步骤进行：

(1)PCR总体系为50μl，包括：

a.2×Direct qRT-PCR Mix：37μL；b.混合酶液:2μL；c.浓度均为10pmol/μl的引物以及探针的混合液：6μL，将上述成分分别依次加入到0.2ml扩增管中；

(2)向步骤(1)的扩增管中加入加待检样本5μl，12000rpm离心5-30秒，将扩增管放入扩增仪中，在以下设定程序下扩增：50℃逆转录10min；95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火30s，40个循环，同时设立阴性对照以及阳性对照，直接在实时定量扩增仪上观察扩增结果；

(3)结果分析

根据扩增结果判定：单独选取FAM，在阴性对照没有Ct值的情况下，Ct值≤35判为口蹄疫病毒阳性；Ct值>35为口蹄疫病毒阴性；单独选取HEX，在阴性对照没有Ct值的情况下，Ct值≤35判为塞尼卡谷病毒阳性；Ct值>35为塞尼卡谷病毒阴性。

9.如权利要求8所述的Taqman实时荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述的待检样本为经过核酸提取液处理后的样本。

10.权利要求1-9任一项所述的Taqman实时荧光定量RT-PCR试剂盒在制备同时检测口蹄疫病毒以及塞尼卡谷病毒试剂中的用途。